Adn Satelite k632t

1.- Diferenciar: ADN Satélite y mini Satélite ADN SATÉLITE Son Secuencias altamente repetitivas de ADN que se encuentran en la heterocromatina, Que se conocen como VNRT(variable number of tándem repeats) traducidos como unidades repetitivas en tándem.los loci VNRT. Están compuestos por secuencias simples (muy cortas) repetidas de una en una y muchas veces para formar grandes bloques de secuencias. Fundamentalmente están cerca de los centrómeros, comprende un total de 250 Mb del genoma humano. Son secuencias de entre 5 y varios cientos de nucleótidos que se repiten en tándem miles de veces generando regiones repetidas con tamaños que oscilan entre 100 kb (100.000 nucleótidos) hasta varias megabases. Reciben su nombre de las observaciones iniciales de centrifugaciones en gradiente de densidad del ADN genómico fragmentado, que reportaban una banda principal correspondiente a la mayor parte del genoma y tres bandas satélite de menor densidad. Esto se debe a que las secuencias satélite tienen una riqueza en nucleótidos A+T superior a la media del genoma y en consecuencia son menos densas. MINISATÉLITES Están compuestas por una unidad básica de secuencia de 6-25 10 nucleótidos que se repite en tándem generando secuencias de entre 100 y 20.000 pares de bases. Se estima que el genoma humano contiene unos 30.000 minisatélites. Diversos estudios han relacionado los minisatélites con procesos de regulación de la expresión génica, como el control del nivel de transcripción, el ayuste (splicing) alternativo o la impronta (imprinting). Asimismo, se han asociado con puntos de fragilidad cromosómica dado que se sitúan próximos a lugares preferentes de rotura cromosómica, translocación genética y recombinación meiótica. Por último, algunos minisatélites humanos (~10%) son hipermutables, presentando una tasa media de mutación entre el 0.5% y el 20% en las células de la línea germinal, siendo así las regiones más inestables del genoma humano conocidas hasta la fecha. En el genoma humano, aproximadamente el 90% de los minisatélites se sitúan en los telómeros de los cromosomas. 2.- ¿A que se denomina Marcador Genético y porque es importante? Se denominan marcadores genéticos a aquellas señales, sean del tipo que sean, que sirven para indicarnos la presencia cercana de un gen de interés en un cromosoma dado. La señal a la que se hace referencia puede ser un rasgo determinado (fenotipo) o bioquímico, y debe ser fácilmente identificable para facilitar la localización de uno o más genes. Pueden indicarnos, por ejemplo, la resistencia a una determinada enfermedad (estrés biótico), tolerancia a salinidad (estrés abiótico), sin necesidad de que las mencionadas situaciones se hayan presentado; en otras palabras, si este organismo tiene tal señal, presentará tal resistencia o tolerancia. ¿Para qué sirven?

El conocimiento de estas asociaciones de señales sirve para predecir las cualidades de un organismo; es decir, la aparición de una de ellas me indicará la presencia de la otra y, con esto, se aceleran los tiempos del proceso de mejoramiento. Los marcadores genéticos pueden ser: morfológicos, bioquímicos y moleculares, cada uno con sus ventajas y desventajas. Los más evidentes son los marcadores morfológicos: coloración, tamaño, rasgos, diferencias en el crecimiento y en el comportamiento, etc. El marcador bioquímico más utilizado es el denominado análisis de isoenzimas. Esta técnica se basa en la separación de enzimas con la misma función, pero diferenciadas en tamaño, carga o conformación. Es una técnica muy utilizada por su sencillez y economía de manejo, pero tiene la limitación de poseer una baja sensibilidad. 3.- ¿Qué son los fragmentos de restricción? ¿Qué es el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción? Encimas de restricción o fragmentos de restricción también llamadas:  

Nucleasas de restricción Endonucleasas de restricción

Reconocen secuencias de bases específicas en el ADN doble hélice y cortan en lugares concretos ambas hebras del dúplex que contienen las secuencias reconocidas. Importancia: 

Gran especificidad de reconocimiento de una secuencia de ADN dúplex y la consiguiente

hidrólisis de un enlace fosfodiéster en cada hebra. RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción) Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Son las variaciones en las bases nitrogenadas en el sitio donde una enzima de restricción corta un segmento de ADN. Estas variaciones afectan el tamaño de los fragmentos que resultan del corte. Los RFLP se pueden utilizar como marcadores en la construcción de mapas físicos y de ligamiento. La técnica RFLP se usa como marcador para identificar: •grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas •en genética forense•en pruebas de paternidad 4.- ¿Qué es el ADN Fingerprinting? El ADN es un compuesto químico que almacena en forma codificada la información genética de un ser humano. Estos perfiles de ADN, únicos por individuo, al igual que las

huellas dactilares, pueden tener amplias aplicaciones en medicina forense, análisis de paternidad, medicina diagnóstica o ciencias naturales. El ADN es idéntico tanto si es extraído de sangre, bulbo piloso o semen. Además, es estable en la línea germinal, por lo que las señas correspondientes a un individuo pueden ser identificadas como pertenecientes a uno u otro progenitor. Estos principios de identidad única, heredabilidad e idéntica estructura del ADN dentro de todos los tejidos del mismo cuerpo son los fundamentos de la técnica de fingerprinting. La historia de esta técnica, se remonta a los trabajos de Jeffreys y col. (1985). Estos autores advierten la presencia en el ADN de regiones en las que una secuencia corta aparece en sucesivas repeticiones (tandem). Estas regiones se denominaron minisatélites. El número de repeticiones de la región, y por lo tanto su tamaño es variable en los alelos de diferentes loci genéticos. Cuando el ADN es aislado y tratado, de modo de obtener fragmentos, la observación del tamaño de lo mismos arroja un perfil diferente para cada individuo (fragmentos de restricción de longitud polimórfica). El perfil varía considerablemente entre personas no emparentadas. Por lo tanto es posible utilizar esta técnica para la identificación de lazos parentales con una eficiencia del más del 99.99%. Por comparación del fingerprinting de la madre y su hijo es posible identificar los fragmentos de ADN presentes en el hijo que están ausentes en la madre y por lo tanto han sido heredados de su padre biológico. Si el presunto padre no es el padre biológico la mayor parte de las bandas de origen paterno identificadas en el hijo no estarán presentes en su fingerprinting. Si por el contratio, el presunto padre es el biológico, todas las bandas paternas del hijo estarán en su fingerprinting. Aplicaciones forenses del estudio del ADN por fingerprinting comprenden: -determinación de identidad de sospechosos en homicidios, violaciones. -confirmación de la veracidad de una evidencia. -identificación de un hecho delictivo como aislado o serial. Las modernas técnicas de análisis del ADN inician un camino de sumo interés por sus aplicaciones en medicina, que incluyen: -determinación de origen genético de mellizos (mono o dicigóticos). -análisis de marcadores para transplante de médula ósea. -detección de cambios de ADN en tumores. -identificación de contaminación entre tejidos materno y fetal en análisis de vellosidades coriónicas. -identificación de patógenos. -estudios familiares para el diagnóstico prenatal de enfermedades de interés. El Instituto de Genética Humana ha implementado desde enero del año 1999 el servicio de determinación de filiación por fingerprinting, iniciando por esta técnica el camino hacia otras de diagnóstico molecular que resulten interés para nuestra ciudad y su zona de influencia.

5.- ¿En qué consiste la técnica del PCR? La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction),

es

una

técnica

debiología

molecular desarrollada

1

en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADNparticular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. Fases: Inicio Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor. Desnaturalización En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización. Alineamiento o unión del cebador A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. Extensión o elongación de la cadena Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la

hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto. Elongación final Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. Conservación Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador. Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.