Sterilisasi 522f2o

STERILISASI I. Tujuan Percobaan 1. Memahami prinsip sterilisasi 2. Memahami dan melakukan metoda-metoda sterilisasi.

3. Mengetahui cara kerja autoklaf 4. Melakukan proses sterilisasi alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi 5. Membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi II. Teori Dasar Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992). Sterilisasai adalah tahap awal yang penting dari proses pengujian mikrobiologi. Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Ada 5 metode umum sterilisasi yaitu : •

Sterilisasi uap (panas lembap)

•

Sterilisasi panas kering

•

Sterilisasi dengan penyaringan

•

Sterilisasi gas

•

Sterilisasi dengan radiasi Metode yang paling umum digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian

mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembap) dan metode sterilisasi panas kering. A. Sterilisasi Uap Sterilisasi uap dilakukan dengan autoklaf menggunakan uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada temperature yang lebih rendah dibandingkan bila tidak ada kelembapan. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organism tersebut.:

Prinsip cara kerja autoklaf Seperti yang telah dijelaskan sebagian pada bab pengenalan alat, autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat & bahan yang menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik. (http://www.idoub.com/doc/16574529/petunjuk-praktikum-mikrobiologi-dasar).

B. Sterilisasi Panas Kering Sterilisasi panas kering biasanya dilakukan dengan menggunakan oven pensteril. Karena panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan uap air panas maka metode ini memerlukan temperature yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang. Sterilisasi panas kering biasanya ditetapkan pada temperature 160-170oC dengan waktu 1-2 jam. Sterilisasi panas kering umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air panas, karena sifatnya yang tidak dapat ditembus atau tidak tahan dengan uap air. Senyawa-senyawa tersebut meliputi minyak lemak, gliserin (berbagai jenis minyak), dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini juga efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah. Karena suhunya sterilisasi yang tinggi sterilisasi panas kering tidak dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan (contoh:alat ukur) dan penutup karet atau plastik. C. Sterilisasi dengan penyaringan Sterilisasi dengan penyaringan dilakukan untuk mensterilisasi cairan yang mudah rusak jika terkena panas atu mudah menguap (volatile). Cairan yang disterilisasi dilewatkan ke suatu saringan (ditekan dengan gaya sentrifugasi atau pompa vakum) yang berpori dengan diameter yang cukup kecil untuk menyaring bakteri. Virus tidak akan tersaring dengan metode ini. D. Sterilisasi gas Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat. Sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi gas biasanya digunakan untuk bahan yang tidak bisa difiltrasi, tidak tahan panas dan tidak tahan radiasi atau cahaya.

E. Sterilisasi dengan radiasi

Radiasi sinar gama atau partikel elektron dapat digunakan untuk mensterilkan jaringan yang telah diawetkan maupun jaringan segar. Untuk jaringan yang dikeringkan secara liofilisasi, sterilisasi radiasi dilakukan pada temperatur kamar (proses dingin) dan tidak mengubah struktur jaringan, tidak meninggalkan residu dan sangat efektif untuk membunuh mikroba dan virus sampai batas tertentu. Sterilisasi jaringan beku dilakukan pada suhu -40 derajat Celsius. Teknologi ini sangat aman untuk diaplikasikan pada jaringan biologi.

III. Alat dan Bahan Alat : - Autoclave

- Batang pengaduk

- Oven

- Spatel

- Erlenmeyer

- Gunting

- Tabung reaksi

- Kertas label

- Cawan petri

- Benang kasur

- Botol media

- Alumunium Foil

- Gelas ukur

- Labu takar

- Kapas

- Kasa asbes

- Kaki tiga

Bahan : - Nutrient Agar - Nutrient Broth

IV. Prosedur Percobaan Cara sterilisasi tabung reaksi dan gelas ukur:

Kapas di bungkus kain kasa dan di ikat dengan benang kasur

bungkusan kapas di masukkan ke mulut tabung reaksi dan labu ukur

emudian permukaannya di tutup dengan alumunium foil dan di ikat menggunakan benang kasur agar tidak terlepas

selanjutnya tabung reaksi dan labu ukur di masukkan ke dalam autoclave

Cara sterilisasi gelas kimia dan labu takar:

permukaan gelas kimia dan labu takar di tutup dengan aluminium foil

selanjutkan gelas kimia dan labu takar di masukkan ke dalam autoclave

Cara sterilisasi cawan petri:

seluruh permukaan cawan petri di bungkus menggunakan kertas hvs

Kemudian cawan petri yang telah dibungkus di masukkan ke dalam autoclave

Cara sterilisasi pipet volume:

kapas dibungkus kain kasa dan di ikat manggunakan benang kasur

bungkusan kapas di masukkan ke dalam mulut pipet volume

selanjutnya ujung mulut di tutup menggunakan alumunium foil

kemudian pipet volume di bungkus dengan kertas hvs secara menyeluruh

masukkan kedalam autoclave

Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer

Nutrien Agar nutrient agar di timbang untuk pembuatan 400ml

Nutrien agar dimasukkan kedalam labu erlenmeyer dan ditambahkan aquades 400 mL

lalu dipanaskan mengunakan Hot plate stirrer dan diaduk menggunakan magnetik stirrer sampai larutan jernih

rutan dibagi menjadi 2 bagian kedalam labu erlenmeyer dan mulut labu erlenmeyer ditutup dengan gulungan kapas

kemudian dilapisi dengan alumunium foil

masukkan kedalam autoclave Nutrien Broth nutrien broth ditimbang unutk pembuatan 200 mL

nutrien broth dimasukkan kedalam labu erlenmeyer dan ditambahkan aquades 200 mL

alu dipanaskan mengunakan Hot plate stirrer dan diaduk menggunakan magnetik stirrer sampai larutan jernih.

tan dibagi menjadi 2 bagian kedalam labu erlenmeyer dan mulut labu erlenmeyer ditutup dengan gulungan kapas

kemudian dilapisi dengan alumunium foil

masukkan kedalam autoclave

V. Data Pengamatan dan Perhitungan Data Pengamatan No

Media

1

Nutrien Agar

T=0 jam •

T=24 jam

Nutrien

Agar

ditambahkan

dengan

Setelah didiamkan selama 24 jam di laboratorium,

Aquades

lalu

larutan

dipanaskan

dan

berubah bentuk dari larutan

menghasilkan larutan

menjadi

Nutrien

agar

berwarna

Agar

yang kuning

muda. •

•

Setelah

menggunakan autoklaf larutan tetap berwarna

Agar

padatan dan

perubahan kuning

disterilisasi

Nutrien

seperti

mengalami warna

muda

kuning keruh.

dari

menjadi

kuning muda. 2

Nutrien Broth

•

•

Nutrien

Broth

•

Setelah didiamkan selama

ditambahkan Aquades

24 jam di laboratorium,

lalu dipanaskan dan

larutan Nutrien Broth tidak

menghasilkan larutan

mengalami

perubahan

Nutrien Broth yang

bentuk

perubahan

berwarna

warna.

Larutan

bening atau jernih.

Broth

tetap

Setelah

kuning bening atau jernih.

kuning disterilisasi

dan

Nutrien berwarna

menggunakan autoklaf larutan tetap berwarna kuning

bening

atau

jernih.

Nutrien Agar setelah di sterilisasi

Gambar ini merupakan madia Nutrien Agar setelah disterilisasi

menggunakan

autoklaf

dan

sudah

didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Nutrien Agar menjadi padatan seperti agar dan berubah warna menjadi kuning agak keruh.

Nutrien broth setelah disterilisasi

Gambar ini merupakan madia Nutrien Broth setelah disterilisasi menggunakan autoklaf dan sudah didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Nutrien Broth tetap berwarna kuning bening atau jernih. Alat-alat yang disterilisasi adalah labu Erlenmeyer, labu takar, pipet volume, gelas ukur, tabung reaksi dan cawan petri. Semua alat yang sudah disterilisasi tidak mengalami perubahan dan dapat dikatakan semua alat dalam keadaan steril. Perhitungan Dit : berat Nutrien Agar yang dibutuhkan untuk pembuatan 200 mL dan berat Nutrien Broth yang dibutuhkan untuk pembuatan 100 mL. Dik : Nutrien Agar : 28 gram untuk 1000 mL, Nutrien Broth : 8 gram untuk 1000 mL Jawab : Nutrien Agar yang dibutuhkan

= 200 mL/1000 mL x 28 gram = 0,2 x 28 = 5,6 gram

Nutrien Broth yang dibutuhkan

= 100 mL/1000 mL x 8 gram = 0,1 x 8 = 0,8 gram

VI. Pembahasan Pada percobaan kali ini dilakukan sterilisasai alat-alat yang berada di laboratorium mikrobiologi. Tujuan dilakukannya sterilisasi alat ialah agar alat-alat yang berada di laboratorium tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme yang ada di lingkungan sekitar. Alatalat yang disterilisasi adalah tabung reaksi, labu ukur, labu takar, labu Erlenmeyer, pipet volume, dan cawan petri. Alat-alat disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Alat-alat yang disterilisasi menggunakan autoklaf merupakan alat-alat gelas yang presisi. Alasan menggunakan autoklaf ialah waktu yang dibutuhkan untuk mensterilkan alat sangkat singkat dan pada suhu 1210C alat gelas tidak akan memuai sehingga tidak akan merubah ukuran alat. Alasan tidak menggunakan oven untuk mensterilkan alat gelas ini karena oven membutuhkan waktu yang lama yaitu 1-2 jam dan membutuhkan suhu yang tinggi 160-170oC. Pada suhu 160-170oC, alat gelas akan memuai sehingga dapat merubah ukuran alat. Sebelum disterilisasi menggunakan autoklaf,semua alat ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi alumunium foil. Tujuannya agar semua alat yang disterilisasi benar-benar steril dari mikroba. Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer. Media yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Pembuatan media Nutrien Broth dilakukan terlebih dahulu karena Nutrien Broth tidak mengandung agar sehingga dapat mudah larut dalam aquades dan waktu yang dibutuhkan untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat. Untuk membuat media Nutrien Broth dibutuhkan 0,8 gram Nutrien Broth dan 100 mL aquades. Nutrien Broth lalu dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan Nutrien Broth dipanaskan menggunakan hot plate stirrer. Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer yang bertujuan agar Nutrien Broth larut sempurna dan menghasilkan larutan yang jernih. Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil.

Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil ialah agar proses sterilisasi media Nutrien Broth berjalan lancar dan menghasilkan media Nutrien Broth yang benar-benar steril. Setelah itu labu Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah 15 menit, labu dikeluarkan dari autoklaf dan menghasilkan larutan Nutrien Broth yang berwarna kuning bening atau jernih sama dengan warna larutan Nutrien Broth sebelum dimasukkan kedalam autoklaf. Setelah itu larutan Nutrien broth didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Pendiaman ini dilakukan karena mikroba atau bakteri dapat berkembang biak dengan cepat dalam waktu 24 jam. Setelah 24 jam didiamkan, larutan tetap berwarna kuning bening atau jernih. Media Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dibandingkan dengan Nutrien Broth control.

Ini merupakan gambar Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dan Nutrien Broth control. Dari gambar terlihat sekali perbedaan warna antara Nutrien Broth yang sudah disterilisasi dan Nutrien Broth control. Warna larutan Nutrien Broth control adalah kuning keruh. Warna kuning keruh ini disebabkan larutan Nutrien Broth ini tidak disterilisasi dan warna kuning keruh ini menandakan bahwa terdapat banyak bakteri didalam larutan Nutrien Broth control dan dapat dikatan tidak steril. Tetapi warna larutan Nutrien Broth adalah kuning bening atau jernih. Warna kuning bening ini menandakan bahwa larutan Nutrien Broth yang sudah disterilisasi ini tidak terdapat bakteri atau mikroba didalam larutan Nutrien Broth atau dapat dikatakan bahwa larutan Nutrien Broth ini sudah steril. Untuk membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 5,6 gram Nutrien Agar dan 200 mL aquades. Langkah kerja pembuatan media Nutrien Agar ini sama seperti pembuatan media

Nutrien Broth. Proses pemanasan larutan Nutrien Agar dibutuhkan suhu 123-1250C. Hal ini dilakukan agar larutan Nutrien Agar menjadi homogen dan tidak cepat memadat. Setelah dilakukan pemanasan dihasilkan Nutrien Agar yang berwarna kuning muda. Lalu larutan Nutrien Agar ini dimasukkan kedalam autoklaf dengan suhu 1210C selama 15 menit. Setelah 15 menit, larutan Nutrien Agar dikeluarkan dari autoklaf dan menghasilkan larutan Nutrien Agar yang berwarna kuning muda sama seperti warna larutan Nutrien Agar sebelum dimasukkan kedalam autoklaf. Sama seperti larutan Nutrien Broth, larutan Nutrien Agar juga didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Setelah didiamkan selama 24 jam, larutan Nutrien Agar berubah bentuk dari larutan menjadi padatan yang menyerupai agar. Selain perubahan bentuk, terjadi juga perubahan warna dari warna kuning muda menjadi warna kuning agak keruh.

VII. Kesimpulan 1. Sterilisasi merupakan suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. 2. Terdapat 5 metode umum sterilisasi yaitu sterilisasi uap, sterilisasi panas kering, sterilisasi dengan penyaringan, sterilisasi gas dan sterilisasi dengan radiasi. 3. Metode sterilisasi uap digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan lainnya yang tahan terhadap temperature yang digunakan dan tahan terhadap penembusan uap air. 4. Larutan Nutrien Agar setelah disterilisasi memadat seperti agar dan berwarna kuning. 5. Larutan Nutrien Broth setelah disterilisasi berwarna kuning bening yang menandakan larutan tidak terkontaminasi dan sudah steril. 6. Prinsip penggunaan autoclave didasarkan pada mikroorganisme, termasuk spora yang

tahan panas, mudah terbunuh dengan panas lembab pada tempratur sedikit di atas titik didih air. VIII. Daftar Pustaka http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-2-media-pertumbuhan.html http://www.idoub.com/doc/16574529/petunjuk-praktikum-mikrobiologi-dasar

Fardiaz, Srikandi. 1992.Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. PAU Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor. Hadioetomo,R.S.1993.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.Granedia,Jakarta. Suriawiria,U.2005.Mikrobiologi Dasar.Papas Sinar Sinanti,Jakarta. Lim,D.1998.Microbiology,2nd Edition,McGrow-hill book,New York.