Práctica 3 - Hidrólisis Enzimática De Almidón 2s3044

Hidrólisis de almidón: análisis enzimático de diastasa INTRODUCCIÓN El almidón es un homo-polisacárido de reserva producido por las plantas. A diferencia de la celulosa, los almidones no son moléculas simples sino mezclas de dos polisacáridos estructuralmente diferentes: amilosa y amolipectina. El almidón puede ser hidrolizado por acción de diastasas (enzimas amilasas que hidrolizan enlaces glicosídicos) o por ácidos inorgánicos. Las enzimas son proteínas con actividad catalítica que aceleran reacciones bioquímicas. La mayoría de las enzimas sigue una cinética de Michaelis-Menten (figura 1). Esta curva se obtiene mediante la determinación de las velocidades iniciales (Vo) de reacción en función de la concentración de sustrato [S]. Se observa al principio una cinética de orden 1, donde la velocidad Vo tiene una dependencia directamente proporcional con la concentración. A concentraciones mayores de sustrato, la velocidad Vo tiene una dependencia de orden 0 con la concentración (región de saturación de la enzima).

Figura 1. Cinética de Michaelis-Menten. La variación de la velocidad inicial con la concentración describe una curva hiperbólica rectangular de 2 parámetros, Vmax y Km. La actividad de las enzimas depende de varios factores fisicoquímicos: la temperatura, el pH, la fuerza iónica, la presencia de inhibidores o activadores, la presencia o ausencia de cofactores (iones y coenzimas), la concentración de sustrato, etc. Para estudiar la actividad de una enzima en distintas condiciones se determinan las constantes cinéticas Km y Vmax a partir de los datos cinéticos. Para ello se pueden aplicar varios métodos de linealización de la ecuación de Michaelis-Menten. Uno de estos es el método de Lineweaver-Burk, donde se grafica el inverso de las velocidades en función del inverso de las concentraciones (figura 2). Km es la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es ½ de la velocidad máxima Vmax.

Figura 2. Gráfico de dobles recíprocos de Lineweaver-Burk. Al hacer la regresión lineal, la pendiente de la recta es igual a Km/Vmax y el intercepto es igual a 1/Vmax. En una reacción enzimática general, la enzima E se une específicamente a un sustrato S y forma un complejo enzima-sustrato (ES). Posteriormente, el producto P se disocia de la enzima. La constante de Michaelis Km comprende las constantes cinéticas de formación (k1) y disociación (k-1) del complejo ES, y la constante de formación del producto (k2), figura 3. Valores pequeños de Km implican valores grandes de k1 y pequeños de k-1, es decir, una mayor tendencia a la formación del complejo enzima-sustrato ES. Así pues, valores pequeños de Km se interpretan como una mayor afinidad de la enzima por el sustrato.

Km=

k −1 + k 2 k1

Figura 3. Reacción enzimática general y significado cinético de la Km. OBJETIVO -

Determinar las constantes cinéticas Km y Vmax de la diastasa (fuente: Aspergillus oryzae, marca Sigma-Aldich) mediante un estudio cinético de hidrolisis de almidón. Identificar los productos de hidrólisis mediante el método de Nelson – Somogyi.

PREGUNTAS PRE-LABORATORIO -

-

¿Qué es el almidón? El almidón, o fécula, es una macromolécula compuesta de dos polisacáridos, la amilosa (en proporción del 25 %) y la amilopectina (75 %).2 Es el glúcido de reserva de la mayoría de los vegetales.3 Gran parte de las propiedades de la harina y de los productos de panadería y repostería pueden explicarse conociendo las características del almidón. ¿Qué son las enzimas amilasas? ¿Cuál es su código EC?

amilasa, es una enzima hidrolasa que tiene la función de catalizar la reacción de hidrólisis de los enlaces 1-4 del componente α-amilasa al digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. Se produce principalmente en las glándulas salivales (sobre todo en las glándulas parótidas) y en el páncreas. Tiene actividad enzimática a un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama, como en la pancreatitis, aumenta la producción de amilasa y aparece elevado su nivel en sangre (amilasemia). El pH óptimo de la amilasa salival es de 6.9. Fue la primera enzima en ser identificada y aislada por Anselme Payen en 1833, quien en un principio la bautizó con el nombre de "diastasa". -

-

¿Cuáles son los productos de hidrólisis del almidón? Almidón Amilasa Dextrinas amilasa Maltosa maltasa Glucosa Las dextrinas son polisacáridos de glucosa de tamaño intermedio. Su brillo y rigidez se debe a la presencia de las dextrinas que se forman cuando se plancha. También se emplean como adhesivos en estampillas, sobres y etiquetas La Amilosa y la Amilopectina son las Cadenas lineales y ramificadas de Alfa Glucosa que forman el Almidón(Polisacárido). Cuando el Almidón se Hhidroliza(se descompone en unidades más simples) por medio de las Amilasas(Salival, Pancreática y la intestinal), este queda convertido en Maltosa(Disacárido formado por la unión de 2 monómeros de Alfa Glucosa) y luego por medio de la Maltasa la Maltosa queda convertida en Glucosa. Entonces, de la Hidrólisis del Almidón se obtienen 2 productos orgánicos, la Maltosa(Disacárido) y la Glucosa(Monosacárido).

- ¿En qué consiste el método de Nelson – Somogyi? La determinación de azúcares reductores mediante el método de Somogyi-Nelson se basa en la capacidad de estos azúcares para reducir agentes oxidantes suaves como el Cu2+.. El Cu2+ se reduce a Cu+, y en presencia de arsenomolibdato amónico forma un complejo de color azul, a partir del cual podemos conocer mediante espectrofotometría la cantidad de cobre reducido, y por lo tanto, de azúcar reductor. PROCEDIMIENTO Preparación de las soluciones de almidón 1. Prepare 50 mL de una solución 0,2% p/v de almidón en agua destilada caliente. Para ello, disuelva 0,1 gramos de almidón en 40 mL de agua destilada previamente calentada en un vaso de precipitados de 100 mL. Para favorecer la solubilidad del almidón, caliente el vaso de precipitados y agite con el agitador de vidrio. Una vez haya disuelto el almidón, retire el vaso del montaje de calentamiento, deje enfriar el vaso con la solución y transfiera cuantitativamente al balón aforado de 50 mL y lleve a la línea de afore con agua destilada. Homogenizar la solución por inversión del balón aforado. 2. Prepare 50 mL de una solución 1,5% p/v de almidón en agua destilada. Para ello, disuelva 0,75 gramos de almidón en 40 mL de agua destilada previamente calentada en un vaso de

precipitados de 100 mL. Para favorecer la solubilidad del almidón, caliente el vaso de precipitados y agite con el agitador de vidrio. Una vez haya disuelto el almidón, retire el vaso del montaje de calentamiento, deje enfriar el vaso con la solución y transfiera cuantitativamente al balón aforado de 50 mL y lleve a la línea de afore con agua destilada. Homogenizar la solución por inversión del balón aforado. Preparación de la solución de diastasa 3. Prepare 20 mL de una solución de diastasa en NaCl 0.1% a un porcentaje de 0.1% p/v en el balón aforado de 20 mL (ver apéndice 2). Estudio de la actividad enzimática en función de la concentración 4. Aliste un montaje de baño de maría con el trípode, la malla de cerámica, el mechero y un vaso de precipitados de 500 mL con agua del grifo. 5. En tubos de ensayo limpios, secos y rotulados, agregue los volúmenes consignados en la tabla 1. Agregue primero el agua, luego el almidón y por último la enzima. Una vez que haya agregado la enzima, inicia la reacción de hidrólisis del almidón. La reacción transcurrirá a temperatura ambiente durante el tiempo que le indique el docente a cada grupo (5 ó 15 min). Homogenizar el contenido de cada tubo cada 2 minutos por inversión.

*Para el tubo Ben (blanco de enzima), adicione la solución azul y la solución amarilla antes de adicionar la enzima. Tabla 1. Volúmenes de sustrato (almidón), enzima (diastasa) y agua destilada para el estudio cinético. 6. Una vez haya transcurrido el tiempo indicado, introduzca los tubos de ensayo en el baño de maría durante 5 minutos para detener la reacción (el calor desnaturaliza la enzima y la inactiva). Mueva los tubos para evitar que salten por sobrecalentamiento.

7. Adicione 1 mL de solución de tartrato de cobre alcalino (Solución azul). Deje los tubos en agua en ebullición por 5 minutos más. Mueva los tubos para evitar que salten por sobrecalentamiento. Debe observarse la aparición de un color amarillento. 8. Deje enfriar los tubos y adicione 1 mL de solución de arsenomolibdato (Solución amarilla). Debe observarse una transición a color azul. Homogeneizar los tubos de ensayo por inversión. Realice este procedimiento con cuidado ya que el sistema se encuentra sobrepresurizado. NOTA: Si el color azul de los tubos es muy intenso y oscuro, haga una dilución 2 a 6 en los tubos de centrífuga. Tenga en cuenta este factor de dilución para los cálculos posteriores. 9. Centrifugar durante 5 minutos a 5000 rpm. Posicione y equilibre correctamente los tubos en la centrífuga. Pida indicaciones del docente en este paso. 10. Agregue en un tubo de ensayo 10 mL de agua destilada, 1 mL de solución azul y 1 mL de solución amarilla. Homogenizar y rotular como tubo B. 11. Medir la absorbancia a 620 nm (ajuste el cero del espectrofotómetro con la solución del tubo B). Diligencie los datos en la tabla 2. Tabla 2. Registro de datos.

ANÁLISIS DE DATOS EXPERIMENTALES -

-

Determine la velocidad de hidrólisis de almidón (mg de glucosa/mL/min) interpolando el dato de la columna 4 de la tabla 2 para cada uno de los tubos (1 a 13) en la curva de calibración de glucosa (una curva para todo el grupo, ver apéndice 1 al final), y dividiendo dicho dato de concentración por el tiempo de reacción. Tenga en cuenta el factor de dilución para los tubos en los que hubo que diluir.

Colum na 1

Columna 2

Columna 3

Columna 4

Tubo

% Almidón

Absorban cia 620 nm (A)

(A) – BE n

BEn 1 2 3 4 5 6 7 8

0.01 0.02 0.03 0.05 0.10 0.15 0.23 0.30

9 10 11 12 13

0.38 0.68 0.98 1.28 1.35

Grafique dichas velocidades en función de la concentración porcentual de almidón (columna 2) en cada tubo para obtener la curva de MichaelisMenten.

-

Construya la gráfica de Lineweaver-Burk, graficando el inverso de la velocidad 1/V (eje Y) contra el inverso de la concentración (1/S).

-

Determine la constante de Michaelis (Km, %p/v almidón) y la velocidad máxima (Vmax, mg de glucosa/mL/min). Convierta la Km a concentración milimolar (mM) de almidón soluble de maíz (MW: 692.661 g/mol) y compárela con la Km para diastasa de otros organismos (consulte en https://www.brenda-enzymes.org/).

-

Explique la función de los reactivos tartrato de cobre y arsenomolibdato, utilizados en el experimento (buscar método de Nelson – Somogyi).

Apéndice 1 Por curso, debe elaborarse una curva de calibración de glucosa. 1. Preparar una solución 0,24 mg/mL de glucosa en agua destilada. 2. Aliste 6 tubos de ensayo y agregue las respectivas cantidades de la solución de glucosa o agua:

3. Desarrolle la reacción de Nelson-Somogyi para cada tubo y mida la absorbancia. 4. Grafique la Absorbancia a 620 nm (Y) vs. la concentración de glucosa (X, mg/mL). Haga la regresión lineal para obtener la línea de tendencia y la fórmula de la ecuación de la recta (Y=mX+b) con r2 (debe ser >0.9). En principio, se puede hacer una curva de calibración para todo el semestre.

Apéndice 2 Cada equipo de laboratorio debe preparar 20 mL de una solución de diastasa al 0.1% p/v en NaCl 0.1%. Para ello, debe tomar una alícuota de 5 mL de la solución stock de diastasa al 0.4% que preparó el profesor, y completar a 20 mL en balón aforado con NaCl al 0.1%. >Al docente Para preparar 100 mL de la solución stock al 0.4%: disuelva 0.4 g de diastasa (frasco Sigma Aldrich) en 50 mL de NaCl al 0.1% en un beaker. Esta se disuelve fácilmente con un poco de agitación.

Posteriormente, transfiera a un balón aforado de 100 mL y complete a volumen con NaCl al 0.1%. Homogeneizar y rotular.