Biologia Celular Y Molecular 4b4nw

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c . Mapas conceptuales e y tablas t u .g sintéticas w Maestro en w Ciencias Bioquímicas wGenaro Matus Ortega n e s o n tí a s i v

Autor: Maestro en Ciencias Bioquímicas Genaro Matus Ortega. Asesor del grupo GUTE: www.gute.com.mx

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Primera parte

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n e DESARROLLO DE HISTORIA Y s LA BIOLOGÍA MOLECULAR o n tí a s i v


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HISTORIA

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Genes ligados, Genes auto y gonosómicos, Herencia citoplásmica,

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Segunda parte

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n e DE ADN Y ARN: ESTRUCTURA s PROPIEDADES DERIVADAS o n tí a s i v


Estructura de la doble hélice

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Purinas

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Adenina

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Guanina

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Purinas

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Pirimidinas

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Adenina

Guanina

Timina

Citosina

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Uracilo

Timina = uracilo metilado Citosina = uracilo aminado

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Timina – uracilo –citosina

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Purinas

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Pirimidinas

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Adenina

Guanina

Timina

Citosina

Pentosa

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Uracilo

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Ribosa RNA

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2’-Desoxiribosa

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DNA

Aldopentosa


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ESTRUCTURA

Estructura del ADN

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Características del modelo de Watson y Crick (1953)

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1.- El DNA está formado por 2 cadenas de polinucleotidos 2.- cada cadena consiste de un grupo fosfato unido a un residuo de -D-desoxirribosa y una base nitrogenada

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3.- las cadenas forman una doble hélice antiparalela 4.- Cada cadena se encuentra de forma perpendicular al eje. 5.- la doble hélice tiene un diámetro de 20 A (2nm)

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6.- la doble hélice gira hacia la derecha del eje siguiendo la orientaión de los azucares.

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7.- por cada 10 pares de bases, la doble hélice da una vuelta completa con una dimensión lineal de 34 A. 8.- las bases nitrogenadas se orientan hacia el interior y las pentosas y fosfatos al exterior 9.- la complementaridad de las bases cumple las leyes de Chargaff (pares purina-pirimidina) 10.- las cadenas de polinucleotidos se unen por puentes de H.

11. Los enlaces fosfatodesoxirribosa están polarizados en sentido opuesto 5’-3’ y 3’-5’


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ESTRUCTURA

Estructura del ARN

3 tipos de RNA participan en la síntesis de proteínas.

Contenido de RNA en la célula

BACTERIAS: 0.5-0.10 pg de RNA, 6% de su peso total

tRNA

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Existen 4 tipos en eucariontes: 18SrRNA, 28SrRNA, 5.8S y 5SrRNA

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mRNA. Contiene al mansaje genético que determina la secuencia de amino ácidos en la síntesis de proteínas.

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Existen diversas copias para cada gen de tRNA (redundancia de genes).

EUCARIOTAS: 20-30 pg de RNA, 1% de su peso total

n e

w

Existen 32 tipos de tRNA en células eucariontes, son pequeños (-4S)

rRNA

Presenta cerca del 70% del RNA total.

m o

Procesamiento de los preRNA---- RNAm.

Cada tipo de tRNA transporta (en su extremo 3´) uno de los 20 aminoácidos

Splicing: remoción de intrones. Eventos de corte: procesamiento de rRNA y tRNA Modificaciones químicas: adición de grupos químicos. Edición del RNA: Modificaciones quimicas *citidin desaminasaconvierte una C a U

Small interfering RNAs (siRNAs)

is

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2 fuentes principales de RNA antisentido

Micro RNAs (miRNAs)


Desnaturalización del ADN

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Desnaturalización del ADN

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x m . Tasas de reasociación del DNA m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

 Según su grado de asociación existen diferentes fracciones genómicas:

A) Componente rápido. Primera fracción de reasociación. Que representa el 25 % del genoma. B)

Componente intermedio. Segunda fracción que corresponde al 30 % del genoma total.

C) Componente lento. La última fracción en renaturalizarse y supone el 45 % restante del genoma total.  ¿Esto significará algo?


x m . Secuencias repetidas y no repetidas m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

 Las secuencias de renaturalización lenta generalmente son regiones de DNA no repetitivas y casi todas las veces codificantes. Según el grado de repetición las secuencias de DNA se clasifican en: A) DNA repetitivo: si están presentes en más de una copia.

B) DNA moderadamente repetitivo: si tienen un rango de reasociación moderado

C) DNA altamente repetitivo: Representa la fracción de reasociación rápida y son producto de la reasociación de secuencias cortas localizadas en tandem en frecuencias de repetición múltiple.   

En este grupo también se encuentra el DNA satélite que consiste de regiones cromosómicas centroméricas inertes (no se transcriben). El DNA microsatelite corresponde a fragmentos más cortos de DNA de alta asociación. El DNA minisatélite o VTNR y las secuencias cortas forman parte de este DNA.


Genes y genomas Concepto fundamental:

Definición:

Gen

Secuencia de DNA que codifica para un RNA funcional.

Genoma

Conjunto de genes codificados en el DNA.

Secuencias no codificantes

Secuencias regulatorias de la duplicación, transcripción o control epigenético.

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Cistron

Unidad monogénica.

Policistron

Unidad poligénica dependiente de un promotor.

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Valor C

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Complementario:

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Densidad génica y genómica

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Contiene información extrínseca e intrínseca.

OriC, ARS, ACS, Intron, Promotor, Terminador, DNA espaciador

Cis-trans (un promotor controla la expresión de un gen).

Cantidad total de DNA en el genoma

Paradoja del valor C

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No correspondencia entre el tamaño del genoma y el número de genes.


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On the fate of duplicated genes……

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Nonfunctionalization

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90% loose function

9% subfunctionalizatión

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Neofunctionalization

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deletereous mutagenesis

Subfunctionalization

conservation

Lynch et al. (2001) Genetics

1% neofunctionalization


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Familias génicas

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Tercera parte

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n CONTROL eDE LA CROMATINA s o n tí a s i v


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Organización del DNA en células eucariontes

Modelos de interacción nucleosoma - DNA

El DNA se asocia a proteínas llamadas HISTONAS

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*ricos en hélices *formación de heterodímeros: H3-H4. H2A-H2B.

w

Es la unidad mínima de construcción de cromatina, involucra todas las histonas excepto la H1.

w

Histonas H1 Histonas nucleosomicas:

Estructura de la cromatina

H2A, H2B, H3, H4

s o n

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Eucromatina (A)

is

CROMOSOMA

v

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El bloque de construcción de la cromatina es el nucleosoma

n e

Heterocromatina

*residuos de fosfato interaccionan con las histonas.

w

*interacciones electrostaticas y puentes de H.

Los extremos amino de las histonas pueden ser modificadas por enzimas: Acetilación, Metilación, Fosforilación.

Regiones de cromatina en metafase

dimeros Octameros (nucleosoma) Cubre 200 pares de bases.

Collar de cuentas solenoide Asas de cromatina


x m La subunidad que se repite en la estructura . de la cromatina es el nucleosoma m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v DNA espaciador

165pb

Los trabajos de A. Klug y colaboradores (1980) sobre la disposición de las histonas en el nucleosoma le valieron el Premio Nobel de Química (1982). Autor: Maestro en Ciencias Bioquímicas Genaro Matus Ortega. Asesor del grupo GUTE: www.gute.com.mx

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DNA

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Nucleosoma

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Fibra de 30 nm (300 Å) o solenoide

Asas o Bucles radiales de DNA

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Las fibras de 30 nm se unen a un armazón proteíco en regiones especificas llamadas SAR [regiones asociadas con el armazón o regiones de unión a la matriz (MAR)].


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CONCEPTO

CONCEPTO NECESARIO

CROMATINA (solo presente en Eucariotas)

Conjunto de ADN, histonas y proteínas.

HISTONAS

Principal proteína presente en las cromatinas.

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.g

Conjunto de octamero de histonas que involucran todas menos la H1

EUCROMATINA

Representa la forma activa de la cromatina.

HETEROCROMATINA

Representa la forma inactiva de la cromatina.

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s o n

REGIONES Y TERRITORIOS NUCLEARES

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CONCEPTO COMPLEMENTARIO Se encuentran en el núcleo de células eucariontes y constituyen el cromosoma eucarionta.

NUCLEOSOMA

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Tienen carga positiva. Ricas en lisina y Argina Consecuencia de genomas grandes Proteínas mas conservadas en eucariontes Cubre 200 pares de base Esta diseminada por el resto del núcleo y aquí se encuentran la mayoría de genes activos. Se localiza en la periferia del núcleo y puede ser de dos tipos: constitutiva y facultativa.

Nucleólos, Dominios OPT, Cuerpo PcG Cuerpo PML, Cuerpos de Cajal,


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x m . Estructura del nucleonema m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a is Nucleolo

 No tiene membranas delimitantes.  Es la estructura subnuclear más prominente.  Producción y ensamblaje de las subunidades ribosomales.  Precursor de 45S  Usa proteínas importadas del citosol = RNP

FC: Centro Fibrilar

DFC: Componente denso fibrilar GC: Componente granular

v


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Cuerpos nucleares

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Cuerpos de Cajal:  Orgánulos esféricos nucleares presentes en células en alta proliferación (tumorales), o metabólicamente activas con alta tasa transcripcional (neuronas).

w

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 Ramón y Cajal las denominó “cuerpos rios nucleolares”, debido a su asociación con el nucléolo en las neuronas.  Su tamaño se sitúa entre 0.1 - 2.0 micrometros y su número es de entre uno a cinco por cada núcleo, variando a lo largo del ciclo celular y entre los diferentes tipos celulares.  Los cuerpos celulares “son posibles lugares de ensamblaje o modificación de la maquinaria de transcripción del núcleo”.  Se encuentran únicamente en los núcleos de plantas, animales y levaduras.

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Cuerpos nucleares

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 Los dominios OPT se relacionan con nuevas síntesis de RNA polimerasa II y dominios que contienen proteínas relacionadas con la transcripción y factores de transcripción TFIIH, Oct1, BRG1, E2F-1, estos pueden representar complejos de iniciación de transcripción incompletos, complejos inhibitorios, o sitios del almacenamiento.

w

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 El complejo grupo Polycomb (PcG, o cuerpo PcG) es una asociación cromatina multiproteica relacionada con la represión estable de mutaciones homeóticas, además de ser un complejo de represión transcripcional.

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Cuerpos nucleares

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 Las manchas -nuclear speckles- son estructuras intranucleares caracterizadas por concentraciones altas de pre-mRNA, aunque su función es polémica, existe evidencia fuerte de que son sitios que unen piezas de almacenaje o ensamblaje.

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 Cuerpos PML. Cuerpos nucleares promielocíticos, donde se sintetiza la proteína PML (882 residuos de aa, 97,5 kDa), cuya su función principales la supresión del crecimiento celular.

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w

 Posee otras funciones relacionadas con la regulación de genes e implicación en las vías de supresión tumoral y, por tanto, de la inhibición del crecimiento celular.

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Cuerpos nucleares Control de la expresión génica

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MEMORIA CELULAR: modificación química de la cromatina

Mediante acetilación, fosforilación, que permiten encender y apagar diferentes genes para formar un tejido específico

DIFERENCIACIÓ DIFERENCIACIÓN Y ESPECIALIZACIÓ ESPECIALIZACIÓN CELULAR: proceso de remodelación de la cromatina

Determina características estructurales y funcionales distintas

ENVEJECIMIENTO CELULAR: mediado por genes

Lleva a 2 tipos de muerte: apoptosis y necrosis

w

CELULAS TOTIPOTENCIALES

w

CELULAS MULTIPOTENCIALES CELULAS OLIGOPOTENCIALES CELULAS DIFERENCIADAS CELULAS ESPECIALIZADAS

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INSULATOR ENHANCER

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SILENCER LCR

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Cuarta parte

w

n e Y REPARACIÓN DUPLICACIÓN s DEL DNA o n tí a s i v


x m . ¿Cómo es la replicación del DNA? m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v


x .m

El oriC

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 El origen de replicación bacteriano se denomina OriC y corresponde a 245 pb.  Tiene las siguientes características:  Es una secuencia rica en A y T.

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w

 Presenta 4 cajas de reconocimiento a DnaA (R1-R4 nonámeros repetidos).

n e

 Tiene 3 repeticiones de treceámeros que permiten la disociación del DNA.

s o n

 Posee secuencias palindrómicas GATC de reconocimiento para las metilasas de Adenina (DAM)

tí a

s i v


5´

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3´

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Proteina DnaA - multicomplejo (10-20) - ATP - se une a los repetidos de 9 pb del OriC - provoca la separación de las cadenas de los repetidos de 13 pb

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Proteina DnaC - “escolta” la DnaB a las DnaA Proteina DnaB (Helicasa) - hexamero - ATP - “abrazadora” alrededor de cad. sencillas - se desplaza a lo largo del DNA para separar las cadenas en el sentido 5´-3´


Inicio de la replicación

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Proteína:

Funciones:

DnaA:

1.- Reconocimiento de OriC, 2.- Curvatura, desestabilización y apertura del DNA, 3.- Reclutamiento de DnaB y DnaC.

w

DnaB, DnaC

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1.- Helicasas que impiden la reasociación del DNA, 2.- Permiten el reclutamiento de SSB y de la DnaG (primasa).

SSB

w

n e

w

1.- Impide la reasociación de las hebras de DNA, 2.- Permite la liberación de DnaA (pre-primosoma)

s o n

DnaG

tí a

s i v

1.- Sólo se integra si DnaC ha sido retirado. 2.- Coloca el cebador de RNA. Define la formación del primosoma. primosoma


x m . Crecimiento de DNA y RNA 5’⇨3’ m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v Se requiere un extremo 3’-OH libre para que ocurra el ataque electrofílico sobre el alcohol.

El crecimiento de cada cadena es unidireccional. La doble hélice crece de manera bidireccional


x m . Elongación de la replicación m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

Proteína:

Funciones:

Hda/Ida:

Permiten que se retire las DnaA

DnaG

Coloca el primer (iniciador, cebador, prímero) de 10-12 nucleótidos de RNA sobre el molde de DNA. Se requiere para dejar un extremo 3’-OH.

Dnapol III

Toma el extremo 3’-OH dejado por la primasa y polimeriza DNA en ambas cadenas (líder continua, retrasada discontinua F. Okazaki). Okazaki F y x permiten la retirada de SSB.

Dnapol I (Rnasa)

Retira los fragmentos de RNA.

Dnapol I (polimerasa)

Rellena los huecos dejados por la actividad de RNAsa.

Dna Ligasa

Sella los fragmentos de Okazaki.


x .m

Hay dos propiedades importantes de las DNA POLIMERASAS:

m o

FIDELIDAD Y PROCESIVIDAD

c . e

FIDELIDAD: El seguimiento exacto de la secuencia que sirve como molde. La actividad de exonucleasa 3’ 5’ de la DNA polimerasa contribuye a la fidelidad pues tiene actividad correctora (proofreading).

w

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PROCESIVIDAD:

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w

La capacidad de una DNA polimerasa de elongar una cadena de DNA por muchos nucleótidos antes de disociarse del complejo que forma con el sustrato. La DNA polimerasa I tiene una procesividad baja. Es distributiva.

tí a

La DNA polimerasa III tiene una procesividad alta.

s i v


La DNA polimerasa III está compuesta por varias subunidades

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Subunidad : 129 kDa, tiene actividad de DNA polimerasa Subunidad : 27.5 kDa, tiene actividad de exonucleasa 3’ 5’

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Subunidad : 41 kDa, se une al DNA. Es el factor de procesividad Subunidad : Factor de dimerización Subnidad : cargado de la hebra de DNA.

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Permiten que se retire SSB

tí a

En ausencia de la subunidad , la DNA Pol III tiene muy baja procesividad, pues se disocia del molde

s i v


x m . Termino de la replicación m o c  El fin de la replicación es mediada por secuencias TerC . ricas en A y T que pueden retrasar e el avance los t replisomas debido a la unión de proteínas Ter y Tus T que u muestran una unión cooperativa.g al DNA. w  La metilación-desmetilaciw ón del OriC permite controlar w cada replicación del DNA los ciclos de inicio de procarionte. n e s  La disponibilidad de las DnaA y los demás factores que o forman el pre-primosoma constituyen un mecanismo de n regulación. tí a s i v


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Eucariotas = más genoma (DNA + proteína)

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oriC

Ter


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Tres características comunes de los orígenes de replicación de procariontes y eucariontes

c . e

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1) Son segmentos de DNA singulares que contienen múltiples secuencias repetidas cortas

w

w

2) Estas unidades repetitivas cortas son reconocidas por proteínas multiméricas ORC (origin recognition complex) que reconocen regiones ARS (Autonomously Replicating Sequence) que se unen al origen para iniciar la replicación

s o n

n e

w

3) Las orígenes de replicación suelen ser regiones ricas en AT, lo que facilita la desnaturalización del duplex de DNA (menos energía).

tí a

s i v


Eucariontes Inferiores - Secuencia de replicación autónoma de S. cerevisiae: ARS (Autonomously Replicating Sequence)

B1

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5´- (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) -3´

A

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B2

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B3

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ARS consensus sequence (ACS)

n e

w

- mutaciones puntuales inhiben el inicio de la replicación - Sitio de unión del ORC (Origin Recognition Complex), 6

s o n

proteínas que forman la maquinaria de iniciación de la replicación)

tí a

- cada 40 kb

- aprox. 400 orígenes de replicación en los 17 cromosomas de S. cerevisiae

s i v

- activación sucesiva de las diferentes ARS: regulación Autor: Maestro en Ciencias Bioquímicas Genaro Matus Ortega. Asesor del grupo GUTE: www.gute.com.mx

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Cdc6 + Cdt1

Xenopus ORC (6 proteínas)

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origen

Degradación ciclinas

Ciclina E/Cdk2 >> Inhibe unión de M/G2 Mcm2-7 (Cdc6) Germinina >> secuestra Cdt1

s o n

P

tí a

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síntesis ciclinas y activación Cdk

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G1

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Helicasas Mcm2-7

w

w

S - Fosforilación Cdc6 y liberación - Fosforilación ORC y Mcm2-7 -Associación Cdc45

P P

P

P Cdc45 P

P


1.-

x Control positivo de la replicación en eucariontes m . m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

Acumulación

de

proteínas

“permisivas” en el núcleo en G1:

- CDC-6 y CDT-1, las cuales se unen al ORC y reclutan las helicasas MCM

- helicasas MCM se unen al DNA y catalizan su desenrollamiento

2.- Una vez que empieza la replicación en la fase S:

- CDC-6 y CDT-1 se despegan del ORC (por fosforilación)

- MCM progresan con el avance de la horquilla de replicación


x Control negativo de la replicación en eucariontesm . m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

• En la célula en fase M/G2 se impide la activacion del ORC, a través de ctd1 y el reclutamiento de las helicasas MCM a las nuevas cadenas de DNA. •Por tanto no se puede iniciar la replicación.

Complejo pre-replicativo

- Ciclina Cdc6, regulador positivo no fosforilado (Expresión alta en G1) - Ctd1

Helicasa Mcm2-7

• En G1, la germinina es degradada, de tal manera que el DNA de la célula pueda responder al control positivo por las proteínas permisivas y iniciar su replicación


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cadena en extensión, incompleta AACCCC-5’ TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’ Cromosoma telomero cadena molde

TELOMERASA

c . e

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Telomerasa con templado 3’ 5’ de RNA AACCCC-5’ ACCCCAAC TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’

w

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3’ 5’ AACCCC-5’ ACCCCAAC TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’

w

n e

Elongación extremo 3’ por la telomerasa

w

Primer RNA CCAAC AACCCC-5’ Adición primer RNA TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’

s o n

tí a

Extensión  DNA polimerasa cadena AACCCC-5’ CCCAACCCCAACCCCCAAC-5’ retrasada por TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3’ la polimerasa

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n e DNA DAÑO EN EL s o n tí a s i v


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x m . AGENTES INDUCTORES DE DAÑO m o Físicos: c . •Radiación ultravioleta e t u •Radiación ionizante g . •Radiación nuclear w Químicos: w w •Agentes químicos n e •Hidrocarburos s •Quimioterapéuticos o n •Radicales libres tí a s i v


x Radiación ultravioleta (200-300nm) .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

1

Entrecruzamiento covalente de pirimidinas adyacentes en la misma cadena de DNA. Generalmente son timinas.

También se puede generar el “fotoproducto 6-4”


Radiaciones ionizantes: Rayos X y rayos gamma.

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2

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Ionizan moléculas que rodean al DNA

radicales libres

.g

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algunos contienen oxígeno que tienen un electrón desapareado. Son especies altamente reactivas y pueden atacar la molécula del DNA causando rupturas en una o en las dos cadenas.

w

w

También pueden químicamente una base, guanina.

s o n

w

modificar como la

n e

Generación de 8-oxo-guanina.

Causa transversiones: GC -> TA

tí a

s i v


Radiación nuclear

x .m

3

m o

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w

n e Enlaces covalentes O-P s o n Extremos tí aromos Translocaciones s i v

Cáncer


x Modificación de bases en el DNA .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a is

4

Las desaminaciones pueden ser espontáneas o inducidas.

v


x .m

Modificación de bases en el DNA: Desaminación por ácido nitroso.

4

m o

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Desaminación de citosina genera uracilo

s i v

n e

w

Desaminación de 5-metil citosina genera timina


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4

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t u

Tipos de Daño al DNA. Alquilación.

w

n e

w

Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) que participan en la formación de puentes de H, desestabiliza la doble hélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación.

s o n

La presencia de estas regiones dañadas puede causar detención de la replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.

tí a

s i v


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Efectos del daño al DNA

m o

c . e

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t u

w

s o n

n e

w

tí a

Veamos la contraparte al daño

s i v


Daño en el DNA CONCEPTO

CONCEPTO NECESARIO

 Causados por: • Errores durante los procesos de replicación, recombinación o reparación del DNA. • Cambios químicos espontáneos

Alteraciones Espontáneas

c . e

Alteración Espontánea: se producen de forma natural o normal en las poblaciones Alteración Inducida: surgen como consecuencia de la exposición a mutágenos químicos o fisicos

.g

t u

Cambios tautoméricos - Formas alternativas isoméricas de las bases nitrogenadas que cambian el patrón de apareamiento normal. depurinación, desaminación y oxidación de Bases. Causados por:  Modificación de Bases en DNA • Agentes químicos (desaminantes, alquilantes) • Agentes físicos  Rayos UV (dimeros de T), Ionizante (radicales libres), Nuclear (extremos romos) Es un proceso constante en la Mecanismos de Reparación: célula, esencial para su Directa supervivencia ya que protege al Apareamiento genoma de daños y mutaciones NER - Reparación por Escisión de Nucleótido dañinas. Recombinación VER Reparación por Escisión de Base

w

w

Alteraciones Inducidas

Reparación del DNA

s o n

tí a

s i v

m o

CONCEPTO COMPLEMENTARIO

Alteración o cambio en la información  genética (genotipo) de un ser vivo.

Mutación

x .m

n e

w


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

n e DEL DNA REPARACIÓN s o n tí a s i v


x Mecanismos de Reparación m . m o c . e t u .g w w w n e s o n a Glucosilasas

RnasaH, Dnapol I, Dnapol ligasa u.v.rABC

RecA, RAD51 Glucosilasas

t í s

i v


x 1. Reparación directa: Fotorreactivación .m m o c . e t u .g Fotoliasas w w w n e s o n tí a s i v


x 1. Reparación directa: Fotorreactivación .m m o c . e t u .g Fotoliasas w w w n e s o n tí a s i v


x m . 2. Actividad de las Glucosilasas (BER) m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

¿Cuál OH es? ¿1’, 2’, 3, 5’? Esto lo responden hasta los que no son “masters”.


x 3. Reparación de apareamientos erróneos (MMR) .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v 1

1. Reconocimiento de la lesión MutSalfa: AE, ins/del (2-8) MutSbeta: ins/del (1-16)

2. Act. ATPasa MutSalfa libera el AE

PCNA

3. Discriminación de la hebra (Okazaki)

RPA- SSDNA

4. Excisión y síntesis de reparación


x .m

4. Reparación de excisión de nucleótidos

m o

NER-TCR c . Acoplada a

NER Genómica Global 1.Reconocimiento XPC/HR23B 2. Entrada del factor TFIIH a la Lesión 3. Ensamblaje del complejo NER 4. Helicasas actúan y XPA-RPA Interactúan con la lesión 5. Endonucleasas:XPG y F 6. Remoción 25-32 n 7. Liberación complejo 8. Síntesis y ligación

s o n

w

.g

e t u

transcripción

w

n e

w

tí a

s i v


x .m

m o

5. uvrABC

c . e

Mecanismo resumido:

1.- UvrA se une al DNA en la región dañada. 2.- UvrB/UvrC tienen actividad de endonucleasa y corta en los lados adyacentes de la cadena liberando un oligonucleótido de unos 12-13 nts de largo.

s o n

n e

w

.g

t u

w

w

3.- La región “vacía” es rellenada por una DNA polimerasa I y

tí a

4.- Sellada por una DNA ligasa.

s i v


•Eucariontes •Libre de error •Fase S y G2

x 6. Recombinación Homóloga .m m o c . e t u .g w w w n e s o n a

t í s

i v


x Intercambio de cadenas mediado m . por REC A O RAD51 (sistema SOS) m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v


x .m

Ruptura

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

7. Reunión de extremos no homólogos

m o

c . e

•Mamíferos •Predispone al error •Fase GO/G1

w

.g

t u

Exonucleasa ssDNA

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


Rescata lo más importante:

x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


Reparación del DNA Agente causal

Daño producido

U. V.

Dímeros de pirimidina (timina- timina, citosina-timina, citosina-cistosina). Fotoproducto 6-4. Bultos y aductos. 8-oxo-guannina. Transversión GC-TA. Ruptura de cadenas (1 y 2), Intercruzamiento.

Radiación nuclear

Ruptura de cadenas de DNA. Extremos romos y adhesivos. Traslocaciones.

Alquilaciones, metilaciones,

w

w

s o n

s i v

w

.g

t u

c . e

Fotoreactivation (UvrABC) NER Recombination Repair. BER NER Recombinación Missmatch repair (MSH, MLH, PMS). Recombination repair (DSB, RPA,RAD52, RAD51).

O6-Etilguanina Cambio en la información (apareamientos erróneos). Timina -Uracilo

Direct Reversal.

Citosina – Uracilo Cambio en la información (apareamientos erróneos).

BER (glicosilasas)

tí a

Desaminaciones Despurinaciones Despirimidaciones

m o

Mecanismo de reparación:

Radiación ionizante (rayos X y )

n e

x .m


x m . Tipos de mutaciones de pares de bases m o c . CATTCACCTGTACCA e t u GTAAGTGGACATGGT .g Sustitución/ Transición w o Transversión w CATCCACCTGTACCA w GTAGGTGGACATGGT n e s CATCACCTGTACCA CATATCACCTGTACCA o GTAGTGGACATGGT n GTATAGTGGACATGGT tí a s i v Secuencia silvestre

Deleción o eliminación

Inserción


x EFECTO DE SUSTITUCIONES EN UN GEN .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v DNA molde : RNAm

5’----T A C---3’ 3’----A T G ---5’

Mutación con sentido erróneo

Mutación sin sentido

Mutación silenciosa

Replicación normal

AAC

TAG

TAT

TAC

TTG

ATC

ATA

ATG

AAC

UAG

UAU

UAC

Codón de asparagina

Codón de terminación

Codón de tirosina

Codón de tirosina

PROTEÍNA DIFERENTE

PROTEÍNA INCOMPLETA

PROTEÍNA NORMAL

PROTEÍNA NORMAL

Carácter conservativo vs no conservativo


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

n e LA TRANSCRIPCIÓN s o n tí a s i v


x .m

La Transcripción m o

c . e

 Proceso celular por el cual los RNAm (y los demás tipos de RNA) son sintetizados a partir de una secuencia de DNA que sirve como molde.

w

.g

t u

w

w

 ¿Es el primer paso de la expresión génica? R = NO.

s o n

n e

 Es el punto principal de control celular de la expresión génica.

tí a

s i v


La Transcripción

•DNA

t u

(mensajero II).

Hebra molde 3’-5’

w

.g

m o

c . e

Se requiere:

•La enzima RNA polimerasa

x .m

Señales de iniciación (promotor) y de terminación

w

w

Secuencias regulatorias.

n e

•Ribonucleótidos (trifosfatados) ATP, GTP, CTP, UTP.

s o n

•Proteínas nucleares o factores de transcripción. •-factores generales o basales de transcripción •-proteínas activadoras o represoras

tí a

interaccionan con secuencias específicas de DNA (secuencias consenso)

s i v


x m . Características de la transcripción m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

 Se copia sólo una de las hebras del DNA.  La discriminación o selección de la hebra a copiar está dada por los promotores.  El super-enrollamiento negativo incrementa la potencia de los promotores.  La actividad de la Rna pol de Procariontes y Eucariontes NO requiere de un cebador.  El transcrito resultante es idéntico a la cadena complementaria a la molde excepto en T-U.  Se requieren nucleótidos trifosfatados para catalizar la reacción de polimerización en sentido 5’-3’.  La transcripción es selectiva. Sólo ocurre bajo control temporal en genes específicos.  Nomenclatura: nucleótido de inicio (n+1), curso abajo (+), curso arriba ().


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

n e LA TRANSCRIPCIÓN s o n tí a s i v


Elementos de control transcripcional en procariotes:

x .m

m o

 Elementos Cis (Cis-acting regulatory sequences): Secuencias de DNA con un determinado arreglo de bases. Tienen función reguladora positiva o negativa. Promotor Mínimo* Promotor proximal*

c . e

w

.g

t u

- Genes constitutivos (Housekeepinkg) - Genes inducibles

w

w

 Proteínas Reguladoras Transactivadoras o Factores de Transcripción Trans (Trans-acting regulatory proteins)

s o n

n e

Proteinas activadores o represores

tí a

s i v


Elementos de control transcripcional en eucariotes:

x .m

m o

 Elementos Cis (Cis-acting regulatory sequences): Secuencias de DNA con un determinado arreglo de bases. Tienen función reguladora positiva o negativa. Promotor Mínimo* Promotor proximal* Potenciadores (Enhancers)* Silenciadores* Elementos de Respuesta*

c . e

w

.g

t u

w

w

 Proteínas Reguladoras Transactivadoras o Factores de Transcripción Trans (Trans-acting regulatory proteins)

s o n

n e

Factores Generales de transcripción* Proteinas activadores o represores

tí a

* Sólo presentes en eucariotas.

s i v


x .m

La enzima que sintetiza RNA es la RNA POLIMERASA (Samuel Weiss y Jerard Huwitz, 1960)

m o

La enzima de E. coli tiene 4 tipos de subunidades

c . e

w

w

Holoenzima formado por: : Reconocimiento del promotor específico

n e

.g

t u

w

: ensamblaje de las unidades y unión al promotor

s o n

’: Se une al DNA

: Sintetiza el RNA : estabiliza la unión de ’ con 2-

tí a

s i v

Es susceptible a inhibición por: RIFAMPICINA y ACTINOMICINA D Autor: Maestro en Ciencias Bioquímicas Genaro Matus Ortega. Asesor del grupo GUTE: www.gute.com.mx

x m . Inhibidores de las RNA polimerasas m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

Derivado de la rifamicina B

ojo

Anticancerígeno-Quimioterapia

Precursor de amatoxinas


x Inicio de la transcripción.m m o c . e t u .g w w w n e s o n a

 La subunidad sigma reconoce la caja de Pribnow en el promotor procarionte.  Alfa permite el ensamblaje de las otras subunidades de la Rna pol.  Se une la subunidad b’ al DNA y b añade 9-10 nt.  Elementos de la región promotora: promotora     

Región -10 TAT AAT (caja de Pribnow) Región -35 TCT TGA CAT Separación de ambas cajas (16-19 pb). Velocidad 20-50 nt Error 10-4 a 37°.

RNA pol

i v

t í s


x .m

Elongación:

m o

1.- Se disocia la subunidad  de la RNA polimerasa. 2.- Comienza la adición de ppp G o ppp A, en el extremo 5’ del RNA naciente. ATP GTP UTP CTP

+

DNA (como molde)

Polimerasa del RNA dirigida por DNA (Mg++)

w

nPPi

w

Sustratos

s o n

n e

w

c . e

t u

5’ 3’ pppApUpGpU…

.g

RNA (tipo, longitud y secuencia de este RNA dependen del gen de DNA que se está transcribiendo)

3.- Se añaden ribonucleótidos polimerizándose la cadena a través de enlaces fosfodiéster (la cadena va creciendo en la dirección 5’ – 3’)

tí a

El RNA que se va copiando del DNA se llama transcrito

s i v


x .m

4.- La “burbuja de transcripción” va avanzando, por un lado se abre el DNA duplex y por el otro se re-bobina. 5.- El RNA sintetizado va formando un híbrido (transitorio), con la cadena 3’ – 5’ del DNA

m o

c . e

RNA polimerasa Rebobinado

t u

Desenrollado

Hebra codificadora Hebra molde

3

w

5

w

Hélice híbrida RNA - DNA 5’ ppp

n e

RNA naciente

w

.g 3

5

3

Punto de elongación

Desplazamiento de la polimerasa

s o n BURBUJA DE TRANSCRIPCIÓN tí a

s i v


x m . Termino de la transcripción: m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

 La Rna pol deja de añadir RNA  La Rna pol se disocia del DNA

 Secuencias de terminación en 5´ respecto al sitio de terminación.  Dos tipos de terminadores respecto al DNA:  Intrínsecos:  Extrínsecos:


    

x m . Terminación en procariontes m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

Terminadores intrínsecos: Serie de 4-10 nt AT consecutivos en 5´. Estructura secundaria en forma de horquilla (harpin) Sucesión de 6 U al final de la horquilla. Generalmente región rica en GC (palindrómica) en la base del tallo.

 Terminadores dependientes de Rho:  Rho actúa como hexámero y tiene actividad de helicasa dependiente de ATP.  Se une a regiones de 50-90 pb en posición 5´ respecto al terminador ricas en C y pobres en G.  Rho avanza en dirección 3´ y desestabiliza la unión de la RNApol cuando llega a la región terminadora.  La desestabilización se debe a la disociación del híbrido DNA:RNA  Es apoyada por NusA que reconoce a box A.


Independiente de Rho

x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

Tramo de uridinas contiguas

tí a

s i v


x .m

Terminación dependiente de Rho:

m o

1.- La RNA polimerasa encuentra señales de terminación en el DNA (región Palindrómica rica en GC y luego en AT). 2.- El RNA se disocia del molde. 3.- La RNA polimerasa se disocia del DNA. 4.- La proteína rho, hidroliza ATP en presencia de RNA o DNA de una sola hebra, rompiendo el DNA del RNA

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

Independiente de Rho

m o

 Palíndrome rico en GC: horquilla

c . e

 Información estructuraldesestabilización.

 Secuencia rica en (T): lineal

w

w

 Información posicional  El ITP (análogo del GTP) ¡impide la terminación! Generando un cambio conformacional.  ¡Pregúntame!

.g

t u

s o n

n e

w

tí a

s i v


Antiterminación

x .m

m o

c . e

 La RNA pol lee más allá de los sitios de terminación.

t u

 Es utilizada por los fagos para regular la transición de una etapa de expresión génica a otra.

w

.g

w

 Proteína antiterminadora (pN, pQ) que reconoce la secuencia antiterminadora en DNA (Box B),

n e

w

 La proteína antiterminadora interacciona con la Rna pol a través de proteínas intermediarias.

s o n

tí a

 El complejo estabiliza a la Rna pol unida Nus A y evita la terminación de la transcripción.

s i v


TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTES

x .m

m o

En procariotes casi todos los RNAm que se van sintetizando se van copiando en proteínas (traducción). Pero los RNA, los RNAt y todos los RNAm de eucariontes sufren modificaciones antes de ser usados o leídos.

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


Anota en tu cuaderno esto:

x .m

m o

c . e

En Eucariontes hay tres tipos de RNA polimerasas

TIPO DE POLIMERASA

t u

GENES QUE TRANSCRIBE

w

.g

RNA polimerasa I

Genes de rRNA 5.8S, 18S y 28S

RNA polimerasa II

Todos los genes que codifican proteínas, los Usn RNA (1-5), los genes plus snoRNA y algunos genes snRNA

RNA polimerasa III

Genes de tRNA, 5S-rRNA, algunos genes snRNA y genes para otros RNAs pequeños (UsnRNA).

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

m o

En Eucariontes hay tres tipos de RNA polimerasas

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

Cada tipo de RNA lleva una forma diferente de PROCESAMIENTO POST-TRANSCRIPCIONAL o MADURACIÓN

m o

c . e

Remoción de los extremos Modificación de la ribosa Modificación de las bases

RNAt

RNAm Euc.

PROCESAMIENTO o MADURACIÓN DIFERENCIAL RNAr

s o n

n e

w

.g

t u

Empalme o splicing Adición del CAP en el extremo 5’ Adición del poliA en el extremo 3’

w

w

Metilación de la ribosa Remoción de partes intermedias de un preRNAr largo que origina varios RNAr más cortos

tí a

s i v


x .m

Rna pol I

Rna pol II

Rna pol III

RNA sintetizado

RNAr (5.8, 18 y 28S)

RNAm UsnRNA (1-5)

RNAt RNAr UsnRNA (6)

Localización

Nucleolo

Nucleoplasma

Sensibilidad a amanitina

No sensible

Muy sensible

Subunidades comunes

2 subunidades grandes similares a  y ´de E. coli 2 subunidades similares a  de E. coli 5 subunidades comunes pero sin homólogos con E. coli

Subunidades totales

14 subunidades

s o n

tí a

s i v

n e

w

t u

12 subunidades Subunidad grande con repeticiones en COO- terminal. Secuencias CTD (carboxi teminal domain): TSP TS 26 repeticiones en levaduras, 56 repeticiones en mamíferos.

w

w

.g

c . e

m o

Nucleoplasma Sensible

17 subunidades


Promotor

Rna pol II

Rna pol III

Dos regiones de control: Core element: -40 a +20 Rico en GC Elemento alrededor del sitio de unión (especie específico). Upstream control element (UCE): -180 a -107.

Tiene variedad de elementos cortos en cis:

Promotor de tRNAs: Dentro de la secuencia transcrita (interna): Caja A Caja B Promotor de 5s rRNAs: Caja A Caja C Promotor de UsnRNA6 Caja TATA PSE OCT-1

n e

UBF1, SL1, TBP

tí a

s o n

s i v

m o

c . e

Promotor mínimo. TATA-like (-30) caja de Golberg-Hogness.

.g

t u

Promotor proximal: CAAT (-80) GGGCGG (-90) caja GC de genes constitutivos

w

w

Factores de transcripción:

x .m

Rna pol I

w

Enhancers.(increment adores, potenciadores, intensificadores…) TBP, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH, TFIIA Pregunta: ¿Si se quita el promotor mínimo habrá transcripción?

Promotor de tRNAs: TFIIBn (incluye TBP) TFIIC Promotor de 5s-rRNAs: TFIIA, TFIIB, TFIIIC.


Inicio de la transcripción:

Rna pol II

Rna pol III

No requiere hidrólisis de ATP. 1. Unión de UBF1 a UCE y en el core. 2. SL1 (TBP-TAF complex) se une a UBF1 de forma cooperativa para extender la región de ADN que es cubierta. 3. Se disoscia hRRN3. 4. Se une la Rna pol I. 5. Se requiere la TIF para iniciar la adición del primer nt.

1. Unión de TBP a la caja de GoldbergHogneess. TBP interactúa con el surco menor del Dna en las TATA y curba la doble hélice. 2. Unión de TFIIB. El C-terminal interacciona con TBP y DNA. El N-terminal se extiende hacia el sitio de inicio de la transcripción. 3. Unión de TFIIF. Provoca el reclutamiento de la RNApol II. 4. Unión de TFIIE: Permite reclutar TFIIH. 5. Unión de TFIIH: TFIIH tiene actividad de helicasa y ATPasa, comienza la síntesis de RNA. 6. La RNA pol se libera de casi todos los TFs.

No requiere hidrólisis de ATP. tRNAs: 1. TFIIC reconoce los elementos control. 2. TFIIB se une a TFIIC y dirige a la Rna pol III al sitio correcto. •TFIIB contiene a TBP que se une al DNA pese a no existir cajas TATA.

s o n

s i v

n e

w

m o

c . e

w

w

tí a

x .m

Rna pol I

.g

t u

5s-rRNAs: TFIIA se une a la caja C, TFIIC se une a TFIIA TFIIIB se une y coloca a la RNA pol en el sitio correcto.


Rna pol I Elongación

Termino de la transcripción

Región reconocida pro la polimerasa (10-12 pb ricos en T). Región reconocido por elementos terminadores Reb1p (10 pb) en S. cerevisiae TTF-1(18 pb) en ratón.

s o n

n e

x .m

Rna pol II

Rna pol III

Requiere factores de elongación DSIF, ELONGATOR, FACT, Spt6, ELL… etc. No clara

-

c . e

m o

w

.g

t u

-

w

w

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

n e MODIFICACIONES s POSTRANSCRIPCIONALES o n tí a s i v


x .m

m o

RNAm Eucarionte: Adición del CAP o “capuchón”

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

7-metil guanosina

s i v


x .m

RNAm Eucarionte: Metilación del CAP

m o

c . e

• Ocurre antes que la cadena tenga 20 nucleotidos de largo.  Se añade un residuo 7-metil guanosina, por una guanililtransferasa en forma reversa.

w

 Se forma un puente 5´-5´ trifosfato

.g

t u

w

 El “capuchón” o “capping” puede estar metilada en O(2´) (1 o dos nucleosidos terminales) o no (cap-0).

s o n

n e

w

tí a

s i v


x RNAm eucarionte: Adición de la cola dem poliA . m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

Secuencias consenso PABP


x .m

m o

RNAm eucarionte: Sólo después de la modificación en 5’ y 3’ ocurre el corte y empalme/ “splicing” de exones

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

Este proceso de remoción de exones es llevado a cabo por un cuerpo de splicing con snRNA catalíticos (Joan Steitz, 1960).

tí a

s i v


x m . RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v


x RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v Esta conducción (transporte y arrastre de RNA) es llevado a cabo por apareamiento de bases formando heteroduplex RNAm-snRNA


x RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v Ex1

Ex2


x m . RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x Functional roles for each snRNP .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

U1 Initially bound to 5'-splice site. Determines which 5'-splice site is used Released on recruitment of U4/U5/U6 ? U2 Initially binds branchpoint sequence. Brings intron 5'-splice site close to the branchpoint

U4 Initially complexed with U5 and U6 Keeps U6 in an unfolded conformation Released after delivering U6 to the 5'-splice site U5 Initially complexed with U4 and U6 Binds exon sequences Location Upstream of 5'-splice site Downstream of 3'-splice site ?

U6 Initially complexed with U4 and U5 Displaces U1 from 5'-splice site Forms duplex with intron sequences Complexes with U2. Brings intron 5'-splice site close to branchpoint


Cromatina y Regulación Transcripcional

x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

Los genes tienen dos regiones distintas funcionalmente:

m o

c . e

Región Codificante

5’ Región Reguladora

PROMOTOR

exón 1

intrón

w

Controla la tasa a la cual la RNApol Transcribe la región codificante del gen.

n e 5’

w

w

mRNA m7Gppp

s o n

.g

t u

3’

exón 2

transcripción

3’

AAAAAA

N

La mayoría de los cambios en los niveles de mRNA ocurren por variaciones en la transcripción.

tí a

s i v


x .m

m o

Componentes de la Región Reguladora de un gen

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


Promotores y la Maquinaria basal de transcripción

x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

n e

Funciones del “Promotor Mínimo”:

s o n

w

•Sitio de unión de la RNApolII, factores generales de transcripción y coactivadores. 

Controla el sitio de inicio de la transcripción y la direccionalidad.

tí a

•Responde a elementos activadores o silenciadores.

s i v

•Necesarios para la transcripción basal


x .m

Promotores y Potenciadores

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

Promotor Proximal: Se encuentran muy cercanos al sitio de inicio de la transcripción aprox. de 50 a 200 pb. A estas regiones se unen proteínas activadoras.

s o n

n e

Potenciador: Potenciadores (“Enhancers”) son secuencias capaces de inducir un incremento en la transcripción de un gen. Se encuentran localizados río arriba o abajo a distancia del sitio de inicio de la transcripción o en Intrones.

tí a

Activadores/ Represores Enhancers / Silencenciadores

s i v


x .m

Organización y Función de un Potenciador:

m o

• Diferentes combinaciones de proteínas activadoras los reconocen.

c . e

 Pueden funcionar de manera tejidoespecifica  Funcionan a distancia e independientemente de la orientación. • Pueden estar compuestos por módulos con diferentes secuencias consenso (cooperatividad).

n e

w

w

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t u

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w

• A los enhancers se unen activadores y otras proteínas con actividad remodeladora

s o n

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tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

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t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x Formación del complejo de inicio de transcripción .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v Ensamblaje

Inicio de la transcripción


x m . Formación del complejo de inicio de transcripción m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v Se abre la doble hélice del DNA (17pb) y se forma la “burbuja de transcripción” DNA desenrollado (17 pb abiertos)

DNA de doble hélice

RNA polimerasa


x .m

Transcripción en Eucariotas.

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

n e REGULACIÓN s POSTRANSCRIPCIONAL o n tí a s i v


x .m

Levels of gene expression regulation in bacteria

m o

Postranscriptional control

Transcriptional control

c . e

DNA

w

mRNA

s o n

tí a

Degradation of RNA

w

Policistronic transcription

s i v

.g

mRNA stability (half life)

t u

n e

w

translation protein

Celular functions

Translational control degradation


Postranscriptional regulation

x .m

m o

c . e

.g

mRNA stability (half life)

w

w

mRNA

s o n

n e

w

t u

Degradation of RNA

mRNA steady-state levels

tí a

s i v


x .m

Eucariotes

m o

c . e

pre-mRNA processing

w

w

mRNA stability & degradation control

protein stability & degradation control

.g

t u

s o n

n e

w

s i v

tí a


x .m

Significado biológico de la estabilidad del mRNA

m o

c . e

t u

La expresión genética es modulada por los niveles estacionarios del mRNA disponibles para la producción de proteínas, los cuales son producto del equilibrio entre la síntesis (transcripción) y la degradación (estabilidad) de los transcritos.

w

.g

w

s o n

n e

w

tí a

Mayor estabilidad mRNA = Mayor expresión genética

s i v


x .m

 Características importantes de la abundancia del mRNA en bacterias:

m o

c . e

¿Qué determina la estabilidad de un mRNA en la célula?

w

.g

t u

w

n e

w

1. ¡ La estructura del RNA !

s o n

2. ¡ La tasa de degradación del RNA ! Actividad de proteínas que degradan el mRNA (Degradosoma y otras ribonucleasas)

tí a

s i v


Toma nota:

x .m

m o La estabilidad y la tasa de degradación del mRNA regulan la c . expresión genética de dos maneras: e t u .g en el cual un mRNA 1. La estabilidad determina el tiempo puede estar presente para w ser traducido w w regulada así misma por 2. La estabilidad del mRNA estímulos del ambiente celular, provee un medio de n e el control de la capacidad respuesta mediante traduccional s o n tí a s i v


x .m

Elementos estructurales del 3´ UTR que regulan la estabilidad del mRNA en eucariontes

m o

mRNA

Elemento estructural

c . e

3´ UTR AUUUA

Algunos

PyBP

AUBP

w

w

Histonas p70

c-myc, c-fos

s o n

Todos

s i v

tí a

n e

t u

Elementos ricos en AU y tractos de Py

An

Py

w

An

.g

Tallo-burbuja del 3´ terminal

Elementos en la región codificante

PABP

AAAAAAAAn

Tracto de poli (A) Jeff Ross 1995


x En eucariontes la degradación del tracto de poli (A) m inicia el decaimiento del mRNA . m o AUG UAA .c e t u g . AUG UAA w w w AUG UAA n e s o n tí a s i v 3´ UTR

7mGpppG

AAAAAAAAA250

Desadenilación

7mGpppG

AAAAAAAAA250

Decapping

pG

A-10

Degradación 3´ – 5´

Jeff Ross 1995


x .m

RNases involved in mRNA degradation in bacteria • RNase E DEGRADOSOME • PNPase

m o

c . e

Poly(A) ribonuclease Endonuclease

.g

t u

Poly(A) ribonuclease Poly(A) polymerase Exonuclease 3´to 5´

w

w

w

n • RNasee II, III s o n a

t í s

i v


x .m

m o

c . e

Ojo: Siempre ocurre una hidrólisis espontánea de los enlaces 5’-5’ y 5’-5’ en ambos extremos.

w

.g

Degradación 3’-5’

t u

La disminución de la poliA y del CAP

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

Differences in mRNA degradation mechanisms bacteria eukayotes

m o

mRNAs are unstable with half lives of minutes to 1 hr

c . e

Endonucleolytic cleavage is the first step in degradation Major via: 3´to 5´. Has not been detected 5´to 3éxoRNases mRNA decay is not linked to 3énd formation

n e

Poly(A) tract destabilize RNAs

s o n

Poly(A) tail length control in importance in mRNA stability ?

tí a

s i v

mRNAs are more stable hours to days Endocleavage is less important Deadenylation 3´- 5´ is the first step Major via: 5´to 3´degradation Degradation mechanisms are linked to 3énd formation and transcription of mRNA

w

.g

t u

w

w

Poly(A) tract, PABs stabilizes mRNAs Poly(A) tail length control is important in mRNA stability CAP-dependent decay mechanisms (decapping enzymes)


x .m

Funciones asociadas a cada componente del degradosoma

m o

c . e

1.- Polinucleótido fosforilasa (PNPasa): Actividad 3’ a 5’ procesativa

t u

2.- RNasa II: No son específicas y son procesativas 3’ a 5’ exoribonucleasa

.g

3.- RNasa D: 3’ a 5’ exoribonucleasa, participa en la maduración de pequeños RNAs estables.

w

4.- RNasa BN: Esencial en la maduración del extremo 3’ de ciertos tRNAs de fagos.

w

w

5.- RNasa T: Maduración del 3’ de pequeños RNAs estables,tRNA y rRNA, reciclamiento de tRNAs 6.- RNasa PH: 3’ a 5’ distributiva

s o n

7.- RNasa R: 3’ a 5’ procesativa

n e

8.- Oligoribonucleasa: Actividad 3’ a 5’ exonucleasa específica para pequeños oligonucleótidos .

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

n e LA TRADUCCIÓN s o n tí a s i v


x .m

La traducción

m o

c . e

proteína

 La traducción corresponde a la síntesis proteica que se lleva a cabo en los ribosomas.  Una vez traducida la información contenida en los RNAm para generar las cadenas de aminoácidos, no hay “vuelta atrás” en el flujo informativo.

s o n

n e

w

.g

t u

mRNA

w

w

 El flujo de información hacia los polipéptidos constituye un proceso irreversible.

tí a

s i v


x .m

Estructura de Ribosomas

Eucariontes

Procariontes

rRNA 23S (2900 bases)

5S (120 bases)

16S (1500 bases)

w

v

s o n

tí a

is

c . e

Proteínas (31)

.g

t u

50S

Proteínas (21)

28S:5.8S (4800+160 bases)

18S (1900 bases)

m o

28S

n e

w

70S 30S

w

Proteínas 5S (50) (120 bases)

60S

5.8S Proteínas (33)

80S 40S


Anatomía de los ribosomas

x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

Traten de no verlo en 2D

m o

c . e

A

P

E

w

.g

t u

E

P

A

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

TRADUCCIÓN

m o

El ensamblado de una proteína requiere los 3 tipos principales de RNA y elementos rios:

c . e

 Ribosomas (RNAr + proteína)

w

 Aminoacil-RNAt  RNAm  proteínas  cationes

s o n

 GTP

.g

t u

w

n e

w

s i v

tí a


x .m

TRADUCCIÓN

m o

LA SÍNTESIS DE UNA CADENA POLIPEPTÍDICA PUEDE DIVIDIRSE EN TRES ETAPAS DISTINTAS

c . e

 Inicio de la cadena  Elongación

n  Terminación e s o n tí a s i v

Met

w

.g

t u

w

w

50S 30S


PASOS GENERALES DE LA TRADUCCIÓN Iniciación: Alargamiento: Terminación:s

o n

x .m

m o

c . e

t u

Formación del complejo de iniciación Colocación del ribosoma en el codón AUG Posicionamiento de la primera metionina

w

.g

Adición de todos los aminoácidos con enlace peptídico entre ellos

w

n e

w

Reconocimiento de codón de terminación y liberación del peptido y del ribosoma

tí a

s i v


1

INICIO

30S

m o AUG

Paso 0.

Reconocimiento de la secuencia señal Shine-Dalgarno por la subunidad menor del ribosoma.

PASO 1. Traslado de la subunidad pequeña al codón de inicio

w

x .m

c . e

t u

.g 2

w

w

PASO 2. Traslado del primer aa-tRNA (f-met) al ribosoma

n e

s o PASO 3. ensamblado del n complejo de inicio completo. tí a s i v

3


x .m

INICIO

m o

c . e

 unión de los factores de iniciación IF-3 e IF-1  unión del RNAm – Secuencia Shine Dalgarno.  unión de la subunidad 30S con el RNAm en el codón de inicio AUG, se requiere de IF1 e IF3

w

w

30S

s o n

AUG

tí a

s i v

n e

w

.g

t u

5-10 nucleótidos

El ribosoma se une al DNA en un sitio preciso La interacción entre estas secuencias La unión a este codón pone al y el Complementarias en el mRNA ribosoma enaelunión marco rRNA lleva dede la lectura= subunidad lectura correcta mensaje 30S al codón dedel inicio


x .m

ELONGACIÓN

m o

c . e

 PASO 1. Selección del aminoacil tRNA  PASO 2. FORMACIÓN DEL ENLACE PEPTÍDICO (liberación de EF-Tu GDP)  PASO 3. TRASLOCACIÓN (dependiente de EF-G e hidrólisis de GTP)

s o n

n e

w

.g

t u

w

w

 PASO 4. LIBERACIÓN DEL tRNA DESACILADO

tí a

s i v


x .m

TERMINACIÓN  La terminación requiere factores de liberación (RF) que reconocen los codones de terminación.

 Codones de terminación. UAA, UAG, UGA  RF1=> UAA y UAG /  RF2 => UAA y UGA

s o n

n e

w

.g

m o

c . e

t u

w

w

 Ruptura del enlace ester entre el aa y su RNAt del último aminoacil-RNAt.

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


Antibiótico

x Inhibidores de la traducción (anótalos) .m m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a is Acción:

Estreptomicina

Tetraciclina

Provoca una mala lectura del código genético en las bacterias a concentraciones relativamente bajas e inhibe la iniciación a concentraciones mayores, enlazándose a la subunidad ribosómica 30s. Se une a la subunidad 30S del ribosoma e inhibe la elongación impidiendo la unión del aminoacil-RNAt (Procariontes) que bloquea el sitio A.

Cloramfenicol

Inhibe a la peptidil transferasa (Procariontes). Bloquea la fase de la transferencia peptídica de la elongación en la subunidad ribosómica 50s, tanto en las bacterias como en las mitocondrias.

Cicloheximida

Impide la elongación bloqueando a la peptidil transferasa de Eucariontes (tóxico, espermicida y mutagénico).

Eritromicina, macrólidos y lincosamidas

Se enlazan a las subunidades ribosómicas 50s, inhibiendo la reacción de la peptidiltransferasa o la traslación, o ambas cosas.

Puromicina

Causa terminación prematura de la traducción. Actúa como análogo estructural del aminoacil-RNAt. Se enlaza al sitio A del ribosoma y participa en la formación de enlaces peptídicos, produciendo peptidil-puromicina.

Toxina diftérica Aminoglucósidos

v

Inhibe a la translocasa eEF-2 (eucariote). Es un péptido de 535 residuos de a.a. unidos por S-S. La tobramicina y la kanamicina evitan la asociación ribosómica al final de la fase de iniciación y provocan una mala lectura del código genético.


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


Complejo de iniciación

x .m

m o

c . e

60 S

w

.g

t u

eIF 4B eIF 6

w

¿Espontáneo?

40 S

s o n

n e

w

eIF 3

eIF-4C

tí a

s i v


x Interacción del complejo ternario con la subunidad m . 40 S para formar el complejo de preiniciación m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v complejo ternario

eIF4C

eIF 3

complejo43-45S de preiniciación


x .m

m o

c . e

4B

4G

eIF4C eIF 3

4A

w

w

4E 5’ Cap

s o n

n e

.g

t u

AUG

w

tí a

s i v


x .m

m o

4A

c . e

4B

4G eIF4C

eIF 3

w

w

5’ Cap

4E

s o n

n e

.g

t u

eIF5

AUG

w

tí a

s i v


x .m

m o

Factores de la iniciación de la traducción (eIFs)

eIF 4F

Ayuda a la union del ribosoma 40 S

4G 4E

c . e

5’ Cap

4A helicasa 60 S

AUG 40AUG S

Reconocimiento y unión al Cap

s o n

tí a

s i v

n e

w

w

w

.g

t u

Alargamiento

Estimula a la helicasa eIF-4B Se una al eIF-3

Factores de reconocimiento al Cap


x .m

m o

c . e

P

.g

AU G

NN N

w

5’ Cap

s o n

n e

A

w

w E

t u

EF-1 .GTP. aatRNA 3’

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

P

.g

AU G

NN N

w

5’ Cap

s o n

n e

A

w

w E

t u

.GTP. aatRNA EF-1 .GDP. 3’

tí a

s i v


x .m

Translocación

m o

c . e

w

w

5’ Cap

s o n

n e

w

.g

t u

P

A

E

AU G

NNN NN N

3’

tí a

s i v


x .m

Translocación

m o

c . e

w

w

5’ Cap

s o n

n e

w

.g

t u

P

A

EF-1a.GTP.aatRNA

E

AU G

NNN NN N

3’

tí a

s i v


x .m

Terminación

m o

c . e

w

.g

t u

eRF 3

P

eRF1.GT P

w

5’ Cap

s o n

n e

w

AUG

A

NNN NN N

NN N

UAG

3’

tí a

Cuando los RFs reconocen a los codones de terminación, activan al ribosoma para que se hidrolice el peptidil tRNA mediante una reacción semejante a la de transferencia del peptidil, solo que el aceptor es H2O en vez del aa-tRNA.

s i v


x .m

m o

c . e

Proteína

w

s o n

n e

t u

RF.GT P

w

5’ Cap

.g

RF 3

w

AU G

NN N

UAG

3’

tí a

s i v


x .m

Terminación

Factor de liberación o de terminación (RF)

m o

Ruptura del enlace éster

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

Los codones UAA, UAG y UGA no son reconocidos por ningún RNAt

tí a

s i v

w

UAA (codón de término) “STOP”

RF1=> UAA y UAG / RF2 => UAA y UGA Autor: Maestro en Ciencias Bioquímicas Genaro Matus Ortega. Asesor del grupo GUTE: www.gute.com.mx

x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

tí a

s i v


x .m IRES: región de unión interna del ribosoma m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v Complejo ternario eIF2

Met

GTP

eIF 3

ITAFs

IRES

AUG

AUG

AUG

pNp

Traducción

RNT 5’

AUG

AUG

ALTO

RNT 3’Poli A

UAA UAG UGA


x Historia: Traducción de Poliovirus.m m o c . e t u .g w w wPoliproteína X IRES n e s o n tí a s i v RNT 5`

Proteínas celularesPTB PCBP2

I

Cap 5’ 1

II

III A U G

AUG

La

IV

eIFs

RNT 3’

V VI

ORF

3’ AAAAA

AUG AUG

743

7441


RNA ribosomal 28 S

x .m

m o

Peptidil-transferasa

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

La resolución atómica de cristales de estructuras de la subunidad ribosomal 60S prueban que la peptidil transferasa, localizada en el centro del ribosoma, esta compuesta en su totalidad por RNA; el ribosoma es una ribozima.

tí a

s i v


x mS RNA ribosomales pequeños 5 y 5.8 . Papel estructural m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v

Se doblan en formas tridimensionales y forman las plataformas en las que se ensamblan las proteinas ribosomales.


x .m

RNA de transferencia A C C

Brazo aceptor 5’ 7pb no Watson

mG

dihidrouridina

w

D

Brazo D

s o n

tí a

Añadido después de la síntesis y procesamiento del tRNA

c . e

.g

t u

El uridilato metilado es timidilato Pseudo uridina

Brazo T  C

w

n e

m o

w

La ribosa se une al carbón 5 en vez de al N 1 del uracilo.

Brazo extra

ANTICODON

is

v

NNN

CODON


Aminoacil tRNA sintetasa

x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

The Aminoacyl Synthetase binds both the anticodon (top) and the amino acid acceptor (bottom) and attaches the appropriate amino acid according to the Genetic Code.

tí a

The exact mechanism by which this recognition takes place is uncertain, and has sometimes been described as a "second genetic code".

s i v


x .m

m o

RNA mensajero (mRNA) 5’

c . e

AUG

Cap

w

w

w

RNT 5’

s o n

.g

t u

UAG- Ámbar UGA- ópalo UAA- ocre

3’ AAAAAAA

RNT 3’

n e ORF

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

n e GENÉTICO EL CÓDIGO s o n tí a s i v


x .m

Extrácto Bacteriano (mezcla de aa y uno radiactivo cada vez)

+ UUU

UUU

UUU

Phe

Phe

+ AAA

AAA

AAA

Lys

+

CCC

CCC

CCC

w

RNAm sintético ACA

Thr

ACA

ACA

tí a

s i v

Thr

s o n

Thr

CAC

n e

w

w

His

.g

Lys

c . e

Lys

Pro

Pro

t u

Pro

ACA

CAC

Thr

His

ACA

ACA

CAC

Thr

Thr

His

m o Phe

Polipeptido

CAC

His

CAC

His

CAC

His


El Código Genético Estándar

x .m

m o

1. Es una regla de correspondencia entre los codones (F. Crick y Sidney Brenner, 1961) y anticodones que permite el acoplamiento o ensamble de los residuos de aminoácidos cargados por la aminoacil-t-RNA sintetasa. 2.

c . e

El codón es un triplete de nucleótidos,

.g

t u

3. El codón constituye una “palabra” en el lenguaje de los ácidos nucléicos que es traducida para codificar un aminoácido. 4. 5.

w

El código es universal, desde las bacterias hasta el hombre *.

w

La interpretación de los codones por aminoácidos es igual en todas las células, todas "leen" de la misma manera los genes.

s o n

n e

w

tí a

s i v


El Código Genético Estándar

x .m

m o

c . e

5. El código esta basado en tripletes, sin puntuaciones ni sobrelapamientos.

t u

6. Posee un codón de inicio* y tres codones de término (UAA, UAG, UGA).

.g

7. Todos los tripletes tienen un sentido y marco de lectura.

w

8. Es un código degenerado (sinonímica o redundancia no uniforme).

w

9. No es ambiguo (es inequívoco)*.

n e

w

10. Tiene un carácter altamente conservativo (atenuador) de mutaciones.. 11. Requiere un “adaptador” para traducir la información genética en proteína (tRNA).

s o n

12. La disponibilidad de los tRNA redundantes (sinonímias) genera la aparición de “dialectos” o índices de uso preferencial de codones (Ichi Ikemura). CAI (codon adaptation index).

tí a

s i v


x El Código Genético Estándar .m m o c . e t u .g w w w n e s o n a

t í s

i v


x El Código Genético Estándar .m m o c . e t u .g w w w n e s o n a

Aminoácidos hidrofóbicos ---hidrofílicos

t í s

i v

Máxima amortiguación en cambios puntuales


x m . La hipótesis del balanceo de Crick m o c . e t u .g w w w n e s o n tí a s i v  La “wobble hypothesis” de Crick proponía que las dos primeras bases del codón deben poseer pares geométricos Watson-Crick normales, mientras la tercera podía ser “solapada”.

 Sólo existen limitaciones estructurales en los dos primeros apareamientos y la tercera base permite flexibilidad y ajustes conformacionales.  De esta forma se necesitarían al menos 31 tRNA aminoacil cargados para leer los 61 codones posibles.  S. cerevisiae sólo tiene 25 aminoaciltRNA para leer el código del mensajero según su ICA.


x .m

Selenocysteine  Selenocysteine is an aminoacid that is present in several enzymes (for example gluthatione, peroxidases, tetraiodothyronine 5' deiodinases, thioredoxin reductases, formatedehydrogenases, glycinereductases and some hydrogenases).

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

 Selenocysteine has a structure similar to cysteine, but with an atom of selenium taking the place of the usual sulfur.

s o n

n e

 Proteins that include a selenocysteine residue are called selenoproteins.

tí a

s i v


x .m

Selenocysteine

m o

c . e

 Selenocysteine is encoded in a special way by a UGA codon, which is normally a stop codon.  The UGA codon is made to encode selenocysteine by the presence of a SECIS (SEleno Cysteine Insertion Sequence) in the mRNA.

w

.g

t u

w

n e

w

 The SECIS element is defined by characteristic nucleotide sequences and secondary structure base-pairing patterns.

s o n

tí a

s i v


x .m

Selenocysteine tRNA

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

 The primary and secondary structure of selenocysteine tRNA, tRNA(Sec), differ from those of standard tRNAs in several respects, most notably in:  An 8-base (bacteria) or 9-base (eukaryotes) pair acceptor stem.  A long variable region arm,  Substitutions at several well-conserved base positions.

s o n

n e

tí a

s i v


x .m

m o

c . e

w

.g

t u

w

w

n e MODIFICACIONES s POSTRADUCCIONALES o n tí a s i v


x ¿Porqué las proteínas son modificadas m . postraduccionalmente? m o c Regulación de la actividad . e t u g . Propiciar interacciones proteína-proteína w w Localización subcelularw n e s Envejecimiento o n tí a s i v  Activar función  Apagar función  Generar una función diferente

 El sitio modificado puede ser una interface de unión.

 El sitio modificado puede ser una señal de localización.

 El sitio modificado puede ser un anclador a la membrana.

 La modificación puede identificar a la proteína para ser degradada.  La modificación puede marcar a una proteína para ser procesada.


x .m

Ejemplos

m o

c . e

•Apropiado plegamiento y propiedades mecánicas mejoradas (ej. Triple hélice del Colágeno) •Solubilidad de las proteínas (carbohidratos)

.g

t u

•Estabilidad o inestabilidad de las proteínas (carbohidratos, ubiquitinación, fosforilación)

w

w

•Procesamiento proteolítico (remoción de secuencia líder)

w

•Localización de proteínas ( anclaje a lípidos de membrana, destino a lisosomas por la presencia de Manosa-6P)

n e

•Regulación de interacciones moleculares (fosforilación, acetilación, acilación, glicosilación).

s o n

tí a

s i v


x .m

Modificaciones postraduccionales

m o

c . e

w

.g

t u

w

s o n

n e

w

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Mann and Jensen, Nature Biotech. 21, 255 (2003) Autor: Maestro en Ciencias Bioquímicas Genaro Matus Ortega. Asesor del grupo GUTE: www.gute.com.mx

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