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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE AGRONOMIA

"Resistencia de tres poblaciones de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) a los insecticidas Tebufenocide y Metoxyfenocide."

Presentado por: ÁNGELA KATHERINE MARTÍN VIVANCO

Tesis para optar el título de: INGENIERO AGRONOMO

Lima -Perú

2015

INDICE

RESUMEN

l.

INTRODUCCIÓN

1

11.

REVISIÓN DE LITERATURA

3

2.1. Aspectos generales de Spodoptera frugiperda (J .E. Smith)

3

2.2. Ciclo de vida

4

2.3. Aspectos generales de la ecdisis o muda

6

2.4. Insecticidas empleados

7

2.4.1. Tebufenocide

8

2.4.2. Metoxyfenocide

9

2.5. Resistencia

1O

2.5.1. Resistencia cruzada

11

2.5.2. Resistencia múltiple

11

2.6. Mecanismos de resistencia a insecticidas 2.6.1. Resistencia a la penetración a. Penetración de los piretroides 2.6.2. Sitio insensible o sitio blanco alterado

11 12 12 13

a. Reducida sensibilidad de la acetilcolinesterasa

13

b. Reducida sensibilidad en el sistema nervioso

13

2.6.3. Resistencia metabólica

14

a. Sistema de oxidación microsomal

15

b. Glutation s-transferasa

15

c. Carboxilesterasas · d. Esterasas

III.

16 16

2. 7. Ensayos toxicológicos

16

MATERIALES Y MÉTODOS

18

3 .1. Diseño de investigación

18

3.2. Población y muestra

18

3.3. Crianza

18

3.4. Crianza individual

20

3.5. Ensayos toxicológicos

20

a. Selección del material vegetal

20

b. Tratamiento

20

c. Testigo

22

d. Infestación en las placas

22

e. Método de evaluación

22

3.6. Procedimiento de análisis de datos

23

3. 7. Razón de resistencia

23

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

24

V.

CONCLUSIONES

32

VI.

RECOMENDACIONES

33

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

34

VIII. ANEXOS

40

INDICE DE CUADROS

Cuadro 1: Clasificación taxonómica de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith)

4

Cuadro 2: Características del producto comercial de Tebufenocide.

8

Cuadro 3: Características del producto comercial de Metoxifenocide

9

Cuadro 4: Reportes de resistencia de insecticidas en Spodoptera

frugiperda (J.E. Smith) Cuadro 5: Características del producto comercial del Adherente

10

22

Cuadro 6. Respuesta del ensayo preliminar en la población del valle de Virú al ingrediente activo Tebufenocide.

24

Cuadro 7. Respuesta del ensayo preliminar en la población de La Molina al ingrediente activo Tebufenocide.

25

Cuadro 8. Respuesta del ensayo preliminar en la población del valle de lea al ingrediente activo Tebufenocide.

25

Cuadro 9. Respuesta del ensayo preliminar en la población del valle de Virú al ingrediente activo Metoxyfenocide.

26

Cuadro 10. Respuesta del ensayo preliminar en la población de La Molina al ingrediente activo Metoxyfenocide.

26

Cuadro 11. Respuesta del ensayo preliminar en la Población del valle de lea al ingrediente activo Metoxyfenocide.

27

Cuadro 12. Caracterización de la susceptibilidad de las poblaciones de Spodopterafrugiperda (J.E. Smith) a Tebufenocide (ecdisteroide).

27

Cuadro 13. Caracterización de la susceptibilidad de las poblaciones de

Spodopterafrugiperda (J.E. Smith) a Methoxyfenocide (ecdisteroide).

29

INDICE DE FIGURAS

Figura l. Estados de desarrollo de S. frugiperda: Posturas y larvas

neonatas (foto a), larvas de segundo y tercer estadío (foto b), larva de último estadío (foto e), pupas (foto d) y adulto (foto e)

5

Figura 2. Frasco para crianza de adultos de Spodoptera frugiperda.

19

Figura 3. Instrumentos y soluciones para bioensayo.

20

Figura 4. Acondicionamiento de mesas para bioensayo.

21

Figura 5. Secado de la superficie de las hojas tratadas para bioensayo.

21

Figura 6. Larva muerta por ecdysteroide.

23

INDICE DE ANEXOS

ANEXO 1: Resultado del análisis estadístico probit para la población de lea

- Metoxyfenocide

40

ANEXO 2: Resultado del análisis estadístico probit para la población de La

Malina- Metoxyfenocide

42

ANEXO 3: Resultado del análisis estadístico pro bit para la población de La

Malina- Metoxyfenocide

44

ANEXO 4: Resultado del análisis estadístico probit para la población de lea

- Tebufenocide

46

ANEXO 5: Resultado del análisis estadístico probit para la población de La

Malina- Tebufenocide

48

ANEXO 6: Resultado del análisis estadístico probit para la población de

Trujillo - Tebufenocide

50

RESUMEN

Se evaluó la resistencia de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) a los insecticidas Tebufenocide y Metoxifenocide, mediante la realización de bioensayos toxicológicos bajo condiciones de laboratorio. Se evaluaron tres poblaciones procedentes de campos de espárrago de los valles de Virú, lea y Rimac, esta última procedente de campos orgánicos, siendo así, considerada como la raza susceptible de referencia. El tratamiento consistió en la inmersión de hojas de Ricinus communis en las soluciones de insecticidas, para luego ser acondicionadas en placas Petri junto a larvas de tercer estadío. Se utilizaron 7 concentraciones logarítmicas para cada insecticida. La CLso estimada para el Tebufenocide fue de 0,51; 0,29; 0,19 (mL P.C. 1 Lagua) para las poblaciones del valle de Virú, lea y Lima, respectivamente; mientras que para Metoxifenocide la CLso estimada fue 0,09; 0,26; O, 18 (mL P.C. 1 Lagua) para las mismas poblaciones, respectivamente. Los resultados demuestran la ocurrencia de leve resistencia al Tebufenocide en las poblaciones de los valles de Virú e lea, con razones de resistencia de 2,7 y 1,5, respectivamente. Por otro lado, la población de lea fue 1,4 veces más resistente al Metoxyfenocide respecto a la población susceptible de referencia. Se recomienda la implementación de un programa de manejo de la resistencia para retardar la evolución de este fenómeno.

Palabras clave: Resistencia, control químico, espárrago, Probit, CLso.

ABSTRACT

The resistance of Spodoptera frugiperda

(J.E.

Smith) to Tebufenozide and

Metoxyfenocide insecticides was evaluated by performing toxicological bioassays under laboratory conditions. Three populations Valley Trujillo, lea and La Molina were evaluated. The latter comes from organic fields, thus being considered as the susceptible reference strain. The execution method consisted of immersing leaves of Ricinus

communis in each insecticida! solution and then conditioning them in petri dishes with third instar larvae. Seven logarithmic concentrations were used for each insecticide. The LCso for Tebufenocide was 0,51; 0,29; 0,19 (mL C.P. 1 Lagua) for Viru, lea and Rimac, respectively, while Metoxyfenozide LCso found were 0,09; 0,26; 0,18 (mL C.P. 1 Lagua) over the same populations respective! y. The results demonstrate the occurrence of a slight resistance to Tebufenocide in populations of Viru and lea, with resistance factors of 2, 7 and 1,5; respectively. On the other hand, the population of lea was 1,4 times more resistant to

metoxyfenocide than the

susceptible

reference

population.

The

implementation of a programme of resistance management is recommended in order to de lay the evolution of this phenomenon.

Key words: Resistance, Chemical control, Asparagus, Pro bit, LCso

l.

INTRODUCCIÓN

Para el cumplimiento de elevados estándares de calidad estética de los alimentos, los productores con frecuencia utilizan el método químico como primera estrategia de control, conllevando a una elevada presión de selección que favorece la evolución de la resistencia a insecticidas. El costo generado por la resistencia de los organismos plaga, tanto para el productor agrícola como para las empresas fabricantes de los insecticidas debería evitarse, mediante un manejo integrado de plagas. La larva de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) es considerada como una de las plagas más importantes del espárrago en la costa norte del Perú, especialmente en los diferentes campos de la irrigación Chavimochic. Para su control se emplean una variedad de plaguicidas, y debido al comportamiento alimentario, esto es, por ubicación debajo de las -

brácteas y raspado en el tercio inferior de los brotes o bien por su ubicación en el tercio de las plantas desarrolladas, el .control de esta plaga a través de las aplicaciones de los insecticidas es complicado. En algunos valles de la costa peruana se ha observado una disminución en. la efectividad de Tebufenocide y Metoxyfenocide para el control de Spodopterafrugiperda (J.E. Smith) en el cultivo de espárrago. Existen varios factores que pueden determinar la disminución de la eficacia de los insecticidas en campo, siendo la resistencia la de mayor relevancia.

OBJETIVOS

l. Evaluar la ocurrencia e intensidad de la resistencia en tres poblaciones de Spodopterafrugiperda al Tebufenocide.

2. Evaluar la ocurrencia e intensidad de la resistencia en tres poblaciones de Spodoptera frugiperda al Metoxyfenocide.

2

11.

2.1.

REVISIÓN DE LITERATURA

Aspectos generales de Spodopterafrugiperda (J.E. Smith, 1797)

Esta especie nativa del trópico pertenece a la familia Noctuidae del orden Lepidoptera (Cuadro 1); se le considera polífaga, tiene como hospederos 23 familias de plantas (Luginbill, 1928 citado por Salinas, 201 0), y genera pérdidas en la mayoría de los cultivos anuales (Ashley et al. 1987 citado por Salinas, 201 0). Esta plaga tiene amplia distribución geográfica en los trópicos de América, desde Argentina y Chile, hasta el sur de Estados Unidos. En Perú está presente en Costa, Sierra y Selva; desde el nivel del mar hasta los 3200m de altitud aproximadamente, por lo que se le considera un problema de importancia no solo por la severidad de los daños que ocasiona sino también por la continuidad con la que se presenta (Sánchez, 1981; Sarmiento et al. 1992 citados por Salinas, 201 0). En la costa norte las infestaciones son económicamente importantes todo el año; en cambio en la costa central y sur las infestaciones disminuyen en el invierno, para luego elevarse a fines de la primavera alcanzando las más altas gradaciones en el verano (Sarmiento, 1981 citado por Vázquez, 2002). S. frugiperda presenta 6 a 8 estadíos. La hembra oviposita en masas sobre el tallo o sobre

el follaje, las posturas están cubiertas por pelos y escamas (Sánchez & Vergara 2003). La larva recién eclosionada se alimenta inmediatamente de tejidos tiernos, en el primer estadío usualmente roe la epidermis de la hoja, dejando manchas traslucidas, en estadíos más avanzados perfora irregularmente el follaje, y más adelante puede destruir plantas pequeñas y estropear las más grandes (Cruz, 1995 citado por Cruz et al. 1999). El insecto empupa en el suelo (Sánchez, et al. 2003). Por otro lado, tienen hábitos caníbales, razón por la cual, se encuentra una sola larva en una planta de espárrago (Asparagus officinalis). El mayor consumo, 80% de la ingesta, lo realizan en los dos últimos estadíos (Álvarez, 1991; Murillo, 1991 citados por Sosa, 2002).

3

La nutrición de la planta juega un nivel importante en la intensidad de la infestación, pues, plantaciones con exceso de fertilizantes nitrogenados serán más atacadas debido al efecto de atracción sobre la plaga producido por el follaje verde. Los tres primeros estadíos requieren menos del2% del follaje total consumido; sin embargo una larva puede llegar a consumir 140 cm2 para completar su desarrollo.

Cuadro l. Clasificación taxonómica de Spodoptera frugiperda. Reino:

Animalia

1Divisi6~:

macho

Arthropoda

Clase:

Insecta

Suborden:

Ditrysia

(sin clasif.): amilia: Subfamilia:

Especie:

Amphiryrinae

Spodopterafrugiperda (J.E. Smith) © 2012 Carol Wolf

Fuente: Wikipedia (20 14)

2.2.

Ciclo de vida

Según Campos, 1968; citado por Sánchez et al., 2004; los estados de desarrollo tienen las siguientes duraciones a 23±2°C de temperatura y 60-70% de humedad relativa: Período de incubación: de 2 a 4 días, período larval de 15 a 24, periodo pupal de 1O a 13 días; total de 27 a 41 días. La longevidad de los adultos es de 12 a 13 días y el número promedio de huevos por hembra es de 1740 (Fig. 1). Existe una correlación estrecha entre la planta hospedera, sobre la cual se alimenta y el peso de la pupa, tamaño del adulto y duración del ciclo biológico. Cuando estas larvas se alimentan de los hospederos no favorables, tienden a incrementar su periodo larval y se presenta un mayor número de estadíos (Sánchez et al., 2004). 4

Figura l. Estados de desarrollo de S. .frugiperda: Posturas y larvas neonatas (foto a), larvas de segundo y tercer estadío (foto b), larva de último estadío (foto e), pupas (foto d) y adulto (foto e).

5

En el espárrago se han reportado de 6 a 7 estadíos larvales, siendo el periodo larval de 20 días aproximadamente. El período de incubación de los huevos es de 5,3 a 5,37 días y el período pupal es de 12,37 días, llegando a ser su ciclo de vida de 34 días (Sártchez et al., 2004). Los adultos son de actividad nocturna, con buena capacidad de dispersión; las hembras ovipositan masas de 150 huevos cubiertos de pelos y escamas (pudiendo llegar hasta 1200 a lo largo de su periodo de vida) prefiriendo los brotes y hojas tiernas del espárrago (Castillo, 2006 citado por Collantes, 2008). Es importante mencionar que en espárrago no se observa el canibalismo de larvas común en maíz, porque las larvas no compiten por espacio (Castillo, s.f. citado por Guardia, 2011). 2.3.

Aspectos generales de la ecdisis o muda

El crecimiento y diferenciación de tejidos durante el desarrollo de los insectos es dirigida por esteroides polihidroxilados, ecdisona, y su interacción con la hormona juvenil, actuando a través de receptores nucleares de transcripción directa. Como resultado de esta interacción se tiene la producción de exoesqueleto cuticular. Después que una nueva cutícula se produce al final de cada estadío, la vieja cutícula debe ser desechada, este desprendimiento es denominado ecdisis (Kingan, et al. 2001). La coordinación de la ecdisis está a cargo de dos grupos de células endocrinas: las células Inka perimétricamente localizadas, las cuales liberan la hormona iniciadora de la ecdisis (HIE); y las neuronas centrales neurosecretoras (neuronas NCN), las cuales liberan la hormona de eclosión (HE). Estos dos grupos se estimulan entre sí: HE actúa sobre las células Inka para provocar la liberación de la HIE. La HIE, a su vez, actúa sobre las neuronas NCN para provocar la liberación de la HE. Como resultado de esta coordinación se da un aumento masivo de HE/HIE en la hemolinfa, así como un comunicado de HE en el sistema nervioso central (Ewer et al., 1997). Se produce entonces la activación de las neuronas que contienen Péptido Crustáceo Cardioactivo (PCCA) (Davis et al. 1993; Dirckensen,

1~94;

citados por Ewer, 1996), lo que eleva su nivel de mono fosfato de

guanosina (GMPc) cíclico celular (Puse & Truman, 2002), justo antes del inicio de la ecdisis, lo cual aumenta la excitabilidad de estas células (Gammie & Truman, 1977 citados por Ewer et al. 1997); Además, estas neuronas (PCCA) son las que originan el

6

aire y cambios circulatorios que acompañan la ecdisis (Reynolds, 1979; citado por Ewer et al., 1997).

Los procesos de ecdisis y eclosión están ligados al ritmo circadiano, y controlada por la EH la cual también influye en el comportamiento y movimientos del insecto. La última etapa de la muda es la esclerotización o endurecimiento de la cutícula (Nijhout, 1994). 2.4.

Insecticidas en estudio

La acción de esteroides análogos a la hormona de la muda fueron descubiertos por Hora y colaboradores en 1966, al ver que se inhibía el endurecimiento de la cutícula de Pyrrhocoris opterus, tras mudar, denominándose a estos compuestos Ecdysonoides

(Slama et al. 1974, citado por Viñuela et al., 1991). Este tipo de sustancias análogas a la ecdysona también se hallan presentes en ecosistemas naturales, ya que dos grupos de plantas relativamente primitivos como son los helechos y gimnospermas contienen ecdysonoides (Fitoecdisonas) que las hace bastante resistentes a los ataques de los insectos

(Harbome, 1982, citado por Viñuela et al. 1991).

Chenopodium album contiene niveles de ecdysonoides que pueden alcanzar valores de

175ppm (Blackford, M., et al., 1996). Los insecticidas reguladores de crecimiento, conocidos como IGRs siglas de Insect Growth Regulators, son productos selectivos que actúan desequilibrando la concentración

de hormonas naturales durante los procesos de crecimiento y desarrollo normal. Entre ellos se encuentran los simuladores de la ecdisoma (Tebufenocide y Metoxyfenocide, perteneciente a la familia de las Diazilhidrazinas) (Quiñones, 2008.citado por Giuggia, et al. 2011 ), los cuales estimulan la ecdisis.

El comité de acción contra la resistencia a insecticidas (IRAC, 2009) clasifica los insecticidas en estudio en el grupo principal 18 correspondiente a los agonistas del receptor de la Ecdisona.

7

2.4.1.

Tebufenocide

Tebufenocide induce una muda prematura y letal en larvas de Lepidóptera durante las 24 horas de tratamiento. La mayoría de las larvas mueren atrapadas en su vieja cutícula. Otros daños incluyen inhibición de la alimentación y pérdida de peso, extrusión del intestino grueso, pérdida de hemolinfa y una fase de pupa anormal y mortal (Smagghe & Degheele, 1994). Moulton et al. (2002), realizaron bioensayos de susceptibilidad al Tebufenocide en poblaciones de Spodoptera exigua (Hübner) de EE.UU y Tailandia. En la población de Tailandia establecieron dos grupos a partir de la población recolectada en campo, uno de ellos fue sometido a selecciones intensas en tres generaciones no consecutivas, y el otro, permaneció como susceptible; en esta población detectaron una normalización de la resistencia, la cepa de laboratorio fue 150 a 1500 veces menos susceptible que la referencial. Ishaaya et al. (1995), reportaron que la efectividad del Tebufenocide en términos de CLso fue de 7 a 14 veces más potente sobre una población de Spodoptera littoralis resistente a piretroides. En el Perú, este insecticida se comercializa bajo el nombre de MIMIC® (Bayer Cropscience) (Cuadro 2). Cuadro 2. Características del producto comercial de Tebufenocide

Nombre comercial

:MIMIC

Concentración

: 240 g L- 1

Toxicidad

: Aguda oral /dérmica para ratas. CLso > 5,000 mg Kg-1 de Peso Vivo.

Fuente: Dow AgroSciences

8

2.4.2.

Metoxyfenocide

Metoxyfenocide en S. littoralis causa deformaciones en adultos tras la aplicación tópica en laboratorio sobre pupas jóvenes (Pineda et al. 2004), disminuye la reproducción de adultos tratados, independientemente del sexo, y la cantidad de huevos (Pineda et al. 2006) y esta se ve más afectada cuando las lavas de S. litoralis son tratadas por el método de ingestión, que por la aplicación tópica; además, se sugiere que este insecticida causa un cambio en la dinámica poblacional de esta plaga debido a la disuasión de la oviposición sobre la superficie de las hojas tratadas (Pineda et al. 2009). En Brasil, Rossato et al. (2006) encontraron diferentes valores de susceptibilidad a Metoxyfenocide, entre dos biotipos de S. frugiperda, siendo el biotipo de arroz 32% más susceptible; Gon<;alves et al. (2003) reportó 95% de eficacia en campo a la dosis de 500mL.ha- 1• Moulton et al. (2002) reportaron en los ensayos realizados en S. exigua el valor de CLso igual a 0,487 mg (LA.) mL- 1 de solución. En el Perú, este insecticida se comercializa bajo el nombre de INTREPID® (Bayer Cropscience) (Cuadro 3).

Cuadro 3. Características del producto comercial de Metoxifenocide

: INTREPID

Nombre comercial l' ''

.

¡~~vJtl~la'c~r_'n~··~: 240g L- 1

Concentración

Toxicidad

:Aguda oral /dérmica CLso > 5,000 mg kg- 1 de Peso Vivo

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Fuente: Dow AgroSciences

9

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2.5.

Resistencia

El comité de acción de resistencia a los insecticidas ó IRAC por sus siglas en inglés, define resistencia como un cambio heredable en la sensibilidad de la población de una plaga que se refleja en repetidos fallos de eficacia del producto al ser usado de acuerdo a las recomendaciones de la etiqueta para esa plaga. La Organización mundial para la salud (Brown y Pal, 1971) citada por Badii & Garza (2007) la define como el desarrollo de la habilidad de una raza de insectos para tolerar dosis de tóxicos que han probado ser letales a la mayoría de individuos en una población normal de la misma especie. S. frugiperda, ha demostrado resistencia a diferentes grupos de insecticidas (Cuadro 4).

La base de datos de resistencia de artrópodos a insecticidas de la universidad del estado de Michigan tiene en su registro 21 ingredientes activos entre los cuales no figuran ninguno de los insecticidas en estudio. 1 Cuadro 4: Reportes de resistencia de insecticidas en Spodoptera frugiperda.

GRUPO DE INSECTICIDA

PAÍS

AUTOR

DDT, ciclodienos,

EUA

Georghiou & Mellon (1983), Yu (1991)

organofosforados, carbamatos y piretroides

Lambda cihalotrin y methomil

Venezuela Morillo et al. (200 1)

Siendo el primer reporte de resistencia en Florida- Estados Unidos de América (EUA) en 1979 por Young & McMillian, con el insectida Carbaryl; este trabajo fue continuado por McCord & Yu en 1987. Los investigadores demostraron que el mecanismo de 1

http://www.pesticideresistance.com/display.php ?page=species&arld=200, 10

resistencia de las poblaciones en cuestión era principalmente la detoxificación del carbaryl por medio de oxidasas microsomales las mismas que actúan hidrolizando las moléculas de carbaryl (Martinelli et al., 2006).

2.5.1. Resistencia cruzada Es el mecanismo por el cual un gen simple confiere resistencia a un número de químicos del mismo grupo (WHO, 1957). Esto se observa cuando una plaga ha sido controlada con . insecticidas de la familia de organoclorados a los que emerge la resistencia y posteriormente se cambia a insecticidas piretroides, los cuales presentan un modo de acción similar a los organoclorados por lo que también se presenta resistencia a esta familia química de insecticidas.

2.5.2. Resistencia múltiple Se presenta cuando una población adquiere resistencia a varios insecticidas, tanto a aquellos que han sido aplicados como a otros que no han sido aplicados. En este caso la población posee varios mecanismos de resistencia de forma simultánea, lo anterior indica que los genes de resistencia ya se encuentran de antemano en la población (Estancias vh, 2011).

2.6.

Mecanismos de resistencia a insecticidas

Existen cuatro categorías (Miller, 1988): l. Resistencia por comportamiento: el insecto no entra en o con el depósito del insecticida. 2. Resistencia a la penetración: donde la composición del exoesqueleto llega a ser modificada inhibiendo la penetración del insecticida. 3. Sitio insensible: el siti9 químico de acción para el insecticida se modifica reduciendo la sensibilidad a la forma activa del insecticida. 4. Resistencia metabólica: la vía metabólica del insecto llega a ser modificada detoxificándose el insecticida o negando el metabolismo del compuesto aplicado en su forma tóxica. La forma más importante de resistencia metabólica incluye la multifunción oxidasa, las glutation s-transferasas y las esterasas. 11

En los insectos los mecanismos más importantes son el sitio insensible y la resistencia metabólica (Bisset, 2002). 2.6.1.

Resistencia a la penetración

También se conoce como mecanismo físico de resistencia y contempla muchos casos de penetración reducida que causan resistencia en los insectos. La velocidad de penetración depende de las características moleculares del insecticida y de las propiedades del tegumento del insecto, las cuales varían considerablemente entre los estadíos de vida y de una especie a otra. Una penetración reducida provee un mayor tiempo para la detoxificación de una dosis tomada (Brattsten et al. 1986, citado por Bisset, 2002). Se ha encontrado que el gen responsable de la resistencia al DDT en moscas domésticas, influye en la penetración del insecticida e incrementa el contenido total de lípidos. Este aumento puede provocar que la liberación de los compuestos lípidos-solubles en el cuerpo del insecto sea lenta, lo que permite un mayor tiempo para que ocurra la detoxificación de los insecticidas (Sawicki y Farnham, 1968). Aumentos en la excreción del insecticida también pueden reducir el efecto tóxico. Un número de insectos dañinos a la agricultura es capaz de alimentarse alimentos naturalmente toxicos o tratados, debido al aumento de los movimientos intestinales. Se plantea que la excreción acelerada de material no metabolizable, no se conoce que sea un mecanismo de resistencia importante contra los insecticidas sintéticos (Brattsten et al. 1986, citado por Bisset, 2002). a.

Penetración de los piretroides

Luego de haber atravesado la barrera del tegumento del insecto, el insecticida puede penetrar, para ser llevado a todas las partes del organismo, en solución, enlazado con proteínas, o disuelto en partículas de lípidos (Zerva, 1988 citado por Bisset, 2002). La penetración depende de: •

Propiedades físico-químicas del insecticida.

•

Formulación del insecticida. -Polaridad del insecticida.

•

Naturaleza del solvente.

12

Existen dos teorías acerca de cómo los insecticidas penetran la cutícula del insecto. La más común es que los no electrolitos penetran por la vía de los canales con poros que existen en la capa de cera o atravesando las membranas inter-segmentales y son translocados luego por la hemolinfa. La otra teoría afirma que un insecticida típicamente aplicado difunde lateralmente a través del tegumento hacia la tráquea y entonces entra al órgano blanco. Quizás, en la práctica, el modo de entrada es más complejo que su difusión lateral o el transporte simple en la hemolinfa. La penetración cuticular de los piretroides puede ocurrir por los canales anastomozados formados en la capa de cera dentro de la cutícula, o a través de regiones cuticulares no esclerotizadas como las áreas intersegmentales, o por la vía del revestimiento traqueal lipofílico, lo cual es más fácilmente accesible desde los espiráculos (Zerva, 1988 citado por Bisset, 2002).

2.6.2.

Sitio insensible o sitio blanco alterado

La resistencia se atribuye también a un mecanismo en el cual los sitios de acción del insecticida se alteran y esto hace que disminuyan la sensibilidad al biocida. Un ejemplo de esto es el de la enzima AchE y la reducida sensibilidad en el sitio de acción. a.

Reducida sensibilidad de la acetilcolinesterasa

En general, una AchE modificada es menos eficiente al hidrolizar su sustrato que una enzima normal. La alteración en los sitios activos causa una disminución en la reactividad con el inhibidor. Los estudios de inhibición sugieren que el a los centros catalíticos de la enzima modificada es restringido por un cambio en su conformación (Voss & Matsumura, 1965 citado por: Bisset, 2002) El cambio de conformación se debe a la asociación de un residuo de aminoácido al centro catalítico de la enzima (Smissaert et al. 1970 citado por Bisset, 2002). b.

Reducida sensibilidad en el sistema nervioso

Se presenta cuando los nervios son menos sensibles, por mutaciones puntuales asociadas con un cambio de aminoá<;ido que trae como consecuencia una reducción en la unión al insecticida sin pérdida de la función primaria del sitio de acción, denominándose este tipo

13

de resistencia como resistencia al derribo o "knockdown" o kdr, la cual se evidencia debido a que los insectos no pierden la coordinación inmediatamente después de una exposición a piretroides y al DDT (Álvarez, L. et al., 2014) Según Shono (1985) la resistencia tipo kdr se debe a la presencia del gen kdr, el cual posee varias características: a) Causa baja sensibilidad hacia el DDT y hacia los piretroides. b) Confiere resistencia a todos los piretroides conocidos hasta ahora. e) Aun solo, puede proveer alta resistencia especialmente cuando el alelo super-kdr está involucrado. d) Este gen es recesivo. Un estudio preciso de este mecanismo de resistencia está obstaculizado por la carencia de un instrumento de diagnóstico para determinar kdr directamente (Miller, 1988).

2.6.3.

Resistencia metabólica

Estudios recientes de detoxificación en insectos revelan que la versatilidad en la adaptación de los insectos a su medio es provista por el fenómeno de inducción. Este es un proceso en el cual un estímulo químico promueve la actividad del sistema de detoxificación mediante la producción de enzimas adicionales. Un total de 12 especies de insectos responden a inductores mediante la producción de niveles incrementados de enzimas como las oxidasas microsomales, deshidroclorinasas, fosfo-transferasas, carboxilesterasas, epoxidohidratasa y sulfotransferasas. Los 3 sistemas de detoxificación más importantes que constituyen la resistencia metabólica en insectos son: las oxidasas microsomales, la glutation s-transferasa, de importancia en el metabolismo de insecticidas organofosforados, y las carboxilesterasas, las cuales degradan carbamatos, organofosforados y piretroides (Terriere, 1984 citado por Bisset, 2002). El insecticida sufre dentro del organismo del insecto una serie de reacciones mediante las cuales adquiere grupos funcionales que le permiten en una segunda fase, conjugarse con sustancias endógenas y dar como resultado compuestos más polares de menor solubilidad en lípidos y como consecuencia más fácilmente excretables. No siempre es necesario que 14

el insecticida se transforme mediante reacciOnes de la primera fase, porque en su estructura puede poseer grupos funcionales que le permitan experimentar directamente las reacciones de la segunda fase (Sotolongo & Vidal, 1988 citados por Bisset, 2002).

a.

Sistema de oxidación microsomal

Oxidasas de función múltiple: Las oxidasas de función múltiple del retículo endoplasmático liso se encuentran en la fracción microsomal de las células, son no específicas y catalizan la reacción siguiente: S+02+NADPH

SO + H20 + NADP

Donde S = insecticida Entre las reacciones de la primera fase aparecen como fundamentales las oxidaciones microsomales que requieren del oxígeno molecular y de la coenzima NADPH. Está comprobado que este sistema hidroxilante contiene, además del NADPH, una flavoproteína (NADPH-citocromo e reductasa), una ferroproteína y un citocromo especializado: el citocromo P-450 (Sotolongo & Vidal, 1988 citados por Bisset, 2002).

b.

Glutation s-transferasa

Tienen gran importancia en la detoxificación metabólica, es una familia de enzimas que catalizan la conjugación del glutatión endógeno a una variedad de compuestos electrofílicos, protegiendo las macromoléculas biológicas como las proteínas y los ácidos nucleicos de las consecuencias tóxicas de una reacción covalente con el insecticida (Board, P. et al. (2000) citado por Díaz, C. et al. (2004)). Se clasifican de acuerdo con la reacción que catalizan como alquil, aril y epoxitransferasas. Las transferasas del glutation son importantes en la detoxificación de organofosforados

y proveen la forma más importante de resistencia metabólica al DDT a través de la dehidroclorinación al DDE.

15

c.

Carboxilesterasas

Estas esterasas poseen capacidad para metabolizar los insecticidas, las cuales por su nombre podría esperarse que hidrolizarán solo los ésteres carboxílicos, así como los piretroides sintéticos y naturales. Sin embargo, el grupo requiere una clasificación más amplia porque los ésteres fosfatos y carbamatos son también atacados. Como la mayoría de los insecticidas de hoy día son ésteres, estas enz1mas son extremadamente- importantes como agentes defensivos. En el caso de los mosquitos (Culex quinquefasciatus) resistentes a organofosforados, la enzima en cuestión se

clasifica como una carboxilesterasa. d.

Esterasas

Según Raymond et al. (1987) citados por Bisset (2002) las esterasas se clasifican en función de la habilidad para hidrolizar los sustratos en 2 tipos: A (hidrolizan preferentemente el 1-naftilacetato) y B (hidrolizan preferentemente el 2-naftilacetato). Ellas pueden estar presentes individualmente en los mosquitos como es el caso de C. quinquefasciatus de California o juntas como en C. quinquefasciatus del este de África.

Callaghan et al. (1991) citados por Bisset, 2002, mostraron la correlación existente entre la elevada actividad de esterasas A y B y la resistencia a insecticidas organofosforados.

4. 7. Ensayos toxicológicos

El ensayo biológico es una herramienta de vigilancia de la resistencia, con el cual se puede determinar la pérdida de susceptibilidad o aumento del nivel de resistencia en una población plaga con respecto a valores de CLso determinados. Aunque la determinación de efectividad y la detección de resistencia son procedimientos muy relacionados, sus objetivos y alcances son diferentes. La determinación de resistencia sólo tiene validez si es avalada por un ensayo, en un proceso conocido como documentación de resistencia (Georghiou y Lagunes, 1991 citados por Georghiou, 1994). Banki (1978) citado por Lagunes-Tejeda et al. (2009) señala que la efectividad biológica de un producto químico que puede inferirse a partir de un bioensayo y Busvine (1971) 16

citado por Lagunes-Tejeda et al., (2009) mencwna que el ensayo cubre todos los experimentos donde la potencia de un insecticida se mide con referencia a una colonia estandarizada de insectos susceptibles. El objetivo del ensayo toxicológico es estimar la dosis que genere respuesta en la población en estudio. Por razones estadísticas, el problema se reduce a determinar el estímulo necesario para obtener una respuesta de 50 % de los organismos de prueba (Busvine, 1971, citado por Lagunes-Tejeda et al. 2009). Este valor se denomina dosis letal mediana (CLso), y es una expresión cuantitativa de la tolerancia de una especie (o raza) en particular a un insecticida, en condiciones experimentales. Además, este valor es una medida de la toxicidad del insecticida usado, donde a menor valor de CLso, mayor toxicidad. Halliday y Burnham (1990) citado por Marcan, P. et al. (2000) indican dos rutas en la detección de resistencia: el uso de técnicas bioquímicas y el uso de ensayos biológicos. Además, añaden que el uso de los ensayos presenta dos modalidades: 1) La determinación de líneas completas dosis-mortalidad; y 2) El empleo de dosis discriminantes. Blair et al. 2007, indican que los ensayos de concentraciones de diagnóstico convencionales con 4 o 5 dosis letales pueden ser una herramienta adecuada para la detección de alelas resistentes, sin embargo, para la los rasgos de resistencia asociada sería necesario para estimar la sensibilidad de ensayos de diagnóstico con mayor precisión. La respuesta de un bioensayo en que se determina la línea dosis-mortalidad de una colonia de campo, se compara en CLso con resultados de colonias susceptibles, calculando la proporción de resistencia al dividir la CLso de la población de campo entre la CLso de la población susceptible (Dhingra y Sarup, 1990). Los resultados de un ensayo para detección de resistencia no se pueden utilizar para determinar la dosis a usar en campo, ya que una determinación de laboratorio no considera las pérdidas producidas por arrastre, fotodescomposición, termorregulación, escape del insecto, etc. En todo caso, la aplicación en el campo de los resultados de un bioensayo para detección de resistencia, permite seleccionar insecticidas para los que la población aún no desarrolla resistencia (Lagunes-Tejeda et al. 2009).

17

111.

3.1.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño de investigación

La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Toxicología de La Universidad Nacional Agraria La Molina, la crianza se realizó bajo condiciones estables de temperatura 25°C (± 2) y humedad relativa 65% (± 3).

3.2.

Población y muestra:

· La especie en estudio fue coleccionada en campos de espárrago en los valles de lea, Virú, y en campos de maíz de La Universidad Nacional Agraria La Molina. Fueron seleccionadas larvas de los últimos estadíos y trasladadas, en recipientes de polipropileno acondicionados, al laboratorio de toxicología de La Universidad Nacional Agraria La Molina. Se asume que la población de la Molina es la población susceptible de referencia, debido a que los insecticidas en estudio nunca han sido utilizados en los cultivos del campus universitario de la La Universidad Nacional Agraria La Molina. 3.3.

Crianza:

La multiplicación y mantenimiento de la especie tuvo como objetivo contar permanentemente con larvas de tercer estadío para la realización de los bioensayos. La técnica de crianza empleada se basó en la metodología propuesta por Armas et al. (1986) con algunas modificaciones (Vásquez, 2002). Las larvas recién emergidas se colocaron en baldes de polipropileno de 5L de capacidad, con hojas tiernas de higuerilla, este recipiente estaba provisto de un agujero en la base para que atraviesen los peciolos de la hoja y tengan o con el agua contenida en un envase de vidrio (Fig. 2). Al alcanzar el tercer estadío las larvas se trasladaron con la 18

punta de un pincel a contenedores plásticos rectangulares de 15L de capacidad con hojas de higuerilla en su interior y se les suministró alimento cada 5 días. Las pre pupas fueron separadas en placas petri, y colocadas alrededor de un algodón humedecido; al pasar al estado de pupa se colocaron en un envase de vidrio de un galón de capacidad, hasta la emergencia de adultos (Fig. 2). Estos frascos contuvieron un algodón humedecido con agua, al emerger los adultos, se colocó papel toalla alrededor como sustrato de ovoposición, la boca del envase de vidrio se cubrió con un papel toalla y se sujetó con una banda de goma elástica. La alimentación de los adultos consistió en una solución de dos cucharadas de azúcar, una cucharada de polen y 15mL de agua. La colecta del papel toalla con las posturas fue inter diaria. El papel que cubría el envase de vidrio debió ser retirada cuidadosamente para no dañar a los adultos que se posaron en la parte superior (Fig. 2). Una vez destapado el frasco se procedió a retirar cuidadosamente el papel toalla con la ayuda de un pincel para repeler a los adultos que estuvieron posados sobre ella (Vásquez, 2002) Se recortó el pedazo de papel con la masa de huevos, la cual fue acondicionada en placa Petri y luego sellada con parafilm, hasta que eclosionen, luego las larvas se trasladaron a los baldes de polipropileno de SL de capacidad acondicionados para repetir el procedimiento.

Figura 2. Envase de vidrio para crianza de

adultos de Spodoptera frugiperda.

19

3.4.

Crianza individual:

Se separaron 1Olarvas y se criaron individualmente en placas Petri que contenían un disco de higuerilla y luego fueron selladas con parafilm, con la finalidad de monitorear el cambio de estadío, el mismo que se reconoció por las exuvias y la capsula cefálica. Esto permitió homologar la crianza mas al y la individual, con el propósito de tener la seguridad de efectuar las pruebas de susceptibilidad con el estadío larval deseado y realizar el bioensayo en el momento oportuno.

3.5.

Ensayos toxicológicos:

a. Selección del material vegetal

Se seleccionaron y coleccionaron hojas de Ricinus communis "higuerilla" de los campos de La Universidad Nacional Agraria La Molina. Estas hojas se cortaron en circunferencias de 5cm de diámetro, las cuales fueron acondicionadas en las placas Petri del mismo diámetro. b. Tratamiento

Las preparaciones de los insecticidas se realizaron en matraces o vasos de precipitado de 1 litro de capacidad (Fig. 3) identificados por tratamientos; 5 concentraciones para ensayos preliminares y 7 concentraciones para ensayos definitivos, y se adicionó 1mL de adherente por litro de caldo. f"

~-----··-

~

-~

~--------

...._.-

--~~.... ~-"

'

Figura 3. Instrumentos y soluciones para bioensayo.

20

La forma de aplicación de los insecticidas fue por el método de inmersión de hojas por un tiempo aproximado de diez segundos por hoja, sostenidas por pinzas y controlado por un cronómetro (Fig. 4), recomendado por el Insecticide Resistance Action Commitee (IRAC) con algunas modificaciones (Vásquez - Castro & Noriega, 2009)

Figura 4. Acondicionamiento de mesas para bioensayo. Luego de la inm~rsión se colocaron las hojas sobre papel toalla bajo sombra a temperatura ambiente (Fig. 5) hasta que la superficie de las hojas esté libre de humedad y se colocaron en placas Petri etiquetadas, junto con un papel filtro "Whatman" número 1, humedecidos con O, 7mL de agua destilada, quedando listas para su infestación con dos larvas. Luego fueron selladas con parafilm.

Figura 5. Secado de la superficie de las hojas tratadas para bioensayo.

21

c.

Testigo

Se vertió un litro de agua destilada en un vaso de precipitado de igual capacidad, y se agregó 1mL de adherente (Cuadro 5). Luego se procedió a realizar el mismo procedimiento operado en los tratamientos.

Cuadro 5. Características del producto comercial del Adherente Nombre comercial

:ADERAL :'Goneériti;ado soluble

Composición química

: 450g. de Oxido nonyl fenol etileno L- 1 y 550g de inertes L- 1• :Dismipuye la terisión·silp@rficial de los.Uquidos'·pl.llverizados . .,

'

1

: 0,5 - 1mL L- de agua.

Dosis

91 · , .'·144· · · L- 1 [Recom~n<Jac~on de u$o .··o·' o6· ·•'~?0·. :mg

Fuente: TQC

d.

Infestación en las placas

Se colocaron 2 larvas de 3er estadía en cada placa Petri, se utilizaron 20 placas por tratamiento y testigo, haciendo un total de 40 larvas por tratamiento.

e.

Método de evaluación

Las evaluaciones se realizaron a las 72 horas de colocar las hojas infestadas en las placas. El criterio que de evaluación de mortalidad de las larvas consistió en detectar la reacción de la misma al tacto con el pincel, las larvas que no se desplazaron se les consideró muertas (Fig. 7). El análisis Probit (Leüra Software 1987) fue realizado para el cálculo de la CLso.

22

i

L_·----·-----------'---~-'-"-'-'------'

Figura 7. Larva muerta por ecdysonoide.

3.6.

Procedimiento de análisis de datos

Una vez realizados los ensayos preliminares se obtuvo una serie de concentraciones para realizar el ensayo definitivo. Estadísticamente, el análisis probit requiere como mínimo 5 dosis con respuestas diferentes y aleatoriamente distribuidas (no todas cercanas al 50% de mortandad) es por eso que en los ensayos definitivos se requiere trabajar con siete dosis (Díaz, et al. 2004). 3.7.

Razón de resistencia

Para cuantificar la resistencia se dividió la CLso de la población en estudio entre la CLso de la población susceptible de referencia.

CLSOr RR = CLSOs RR: Razón de resistencia. CL50r: Dosis letal media de la población resistente. CL50s: Dosis letal media de la población de referencia.

23

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Se evaluó la ocurrencia de resistencia a dos ecdysonoides mediante la ejecución de ensayos preliminares compuestos por 5 dosis que posteriormente servirían de base para establecer las dosis adecuadas para cada insecticida.

Cuadro 6. Respuesta del ensayo preliminar en la población del valle de Virú al ingrediente activo Tebufenocide.

Dosis (mg.L- 1)

Individuos muertos Individuos evaluados

% de mortandad

:•········22:

itH3,~

0,016

2

20

10,0

0,16

1

18

5,6

1,8

16

18

88,9

.

En el Cuadro 6 se obtuvieron las siguientes dosis para el ensayo definitivo: 2,3; 1,6; 1,3; 0,9; 0,5; 0,4; 0,3; y el testigo.

24

1

Cuadro 7. Respuesta del ensayo preliminar en la población de La Molina al ingrediente activo Tebufenocide. Dosis (mg.L- 1)

Individuos muertos Individuos evaluados

%de mortandad

0,016

2

20

10,0

0,16

8

20

40,0

1,8

20

20

100,0

En el Cuadro 7 se obtuvieron las siguientes dosis para el ensayo definitivo: 1,6; 1,2; 0,8; 0,5; 0,05; 0,05; 0,016; 0,008 y testigo. Cuadro 8. Respuesta del ensayo preliminar en la población del valle de lea al ingrediente activo Tebufenocide. Dosis (mg.L- 1)

Individuos muertos Individuos evaluados

0,016

0,16

1,8

%de mortandad

1

20

5,0

4

18

22,2

18

19

94,7

En el Cuadro 8 se obtuvieron las siguientes dosis para el ensayo definitivo: 1,6; 1,2; 0,8; 0,5; 0,4; 0,3; 0,16 y testigo.

25

Cuadro 9. Respuesta del ensayo preliminar en la población del valle de Virú al

ingrediente activo Metoxyfenocide. Dosis (mg.L- 1)

Individuos muertos Individuos evaluados

% de mortandad

0,3

9

18

50,0

1

14

19

73,7

1,8

19

20

95,0

En el Cuadro 9 se obtuvieron las siguientes dosis para el ensayo definitivo: 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2; 0,1; 0,05 y testigo.

Cuadro 10. Respuesta del ensayo preliminar en la población de La Molina al

ingrediente activo Metoxyfenocide. Dosis (mg.L- 1)

0,3

Individuos muertos Individuos evaluados

% de mortandad

10

19

52,6

20

20

100,0

1

1,8

En el Cuadro 10 se obtuvieron las siguientes dosis para el ensayo definitivo: 0,6; 0,5; 0,35; 0,2; 0,1; 0,05; 0,01 y testigo.

26

Cuadro 11. Respuesta del ensayo preliminar en la Población del valle de lea al ingrediente activo Metoxyfenocide.

Dosis (mg.L-1)

Individuos muertos Individuos evaluados

15,8

19

3

1

% de mortandad

1,8 En el Cuadro 11 se obtuvieron las siguientes dosis para el ensayo definitivo: 0,6; 0,4;

0,2; O, 1; 0,08; 0,06; 0,02 y testigo. En la ejecución de los ensayos preliminares con las dosis establecidas se halló resistencia al ingrediente activo de tebufenocide y suceptibilidad a metoxyfenocide en la población del valle de Virú. Sin embargo la población de lea mostró una ligera resistencia a ambos insecticidas.

Cuadro 12. Caracterización de la susceptibilidad de las poblaciones de Spodoptera frugiperda a Tebufenocide (ecdisteroide).

Población

CLso

IC 95%

Pendiente

Heterogeneidad RR

±EE

X2

gl

lea

0,288

0,22-0,35

2,46±0,39

1,217

4

0,3

1,5

Virú

0,514

0,35-0,67

1,66±0,29

1,496

5

0,3

2,6

CLso: Concentración letal media (mL P.C. 1 Lagua); IC: Intervalo de confianza al 95%; EE: Error estándar de la media; X 2 Chi cuadrado; gl: grados de libertad; RR: Razón de resistencia.

27

Para el

ingrediente activo Tebufenocide se estimó una dosis letal

media

de

0,29mL P.C. 1 Lagua para la población de lea (Cuadro 12), este valor se encuentra en un intervalo de confianza de 0,22 a 0,35 al 95%, la pendiente de la recta estimada es de 2,46 y la desviación estándar es de ±0,39, el valor de Chi cuadrado es igual a 1,22 lo cual

indica una baja heterogeneidad calculada en 0,3. Este valor de Chi cuadrado comparado al tabulado de 9,5 (con 4 grados de libertad), es una representación satisfactoria de los datos del experimento. La respuesta a Tebufenocide en la población de La Molina coleccionada en los campos orgánicos de la Universidad Nacional Agraria La Molina se detectó una CLso de 0,19 (Cuadro 12). Los intervalos de confianza al 95% muestran que el verdadero valor se encuentra entre 0,09 y 0,39; el valor de la pendiente es cercano a 1 con un error estándar de ±0,11. El valor de Chi cuadrado es menor a 11,07 (valor tabular) con 5 grados de libertad lo cual valida los datos obtenidos aún con valores de 1,62 de heterogeneidad. La concentración letal media de la población del valle de Virú para Tebufenocide fue de 0,51 en un intervalo de confianza de 0,35 a 0,67 al95%, la pendiente es igual a 1,66 con un error ~e ±0,29. El valor de Chi cuadrado igual a 1,496 (5 grados de libertad) indica el ajuste satisfactorio de los datos. Para el insecticida de Tebufenocide se observa (Cuadro 12) que la población del valle de lea presentó una razón de resistencia de 1,5; mientras que la razón de resistencia de la población del valle de Virú fue de 2,6 veces más resistente que la población referente.

28

Cuadro 13. Caracterización de la susceptibilidad de las poblaciones de Spodoptera frugiperda a Methoxyfenocide (ecdisteroide).

Población

lea

Virú

CLso

IC95%

Pendiente ±EE

X2

gl

Heterogeneidad

RR

1,4

0,255

0,17-0,36

1,87±0,41

1,787

4

0,45

0,181

0,13-0,23

2,93±0,47

3,160

4

0,79

0,089

0,07-0,11

2,32±0,34

2,693

3

0,90

0,5

CL5o: Concentración letal media (mL P.C. 1 Lagua); IC: Intervalo de confianza al 95%; EE: Error estándar de la media; X 2 Chi cuadrado; gl: grados de libertad; RR: Razón de resistencia.

En el bioensayo realizado en la población de lea con el ingrediente activo Metoxifenocide se estimó una dosis letal media de 0,26 mL P.C. 1Lagua (Cuadro 13), con un intervalo de confianza (95%) de 0,17 a 0,36, una pendiente igual a 1,87 y desviación estándar de ±0,41, el valor de Chi cuadrado es igual a 1,79 reflejada en una respuesta homogénea. Así mismo para la población La Molina se detectó una CLso de O, 18 (Cuadro 13), con un intervalo de confianza de O, 1, con una pendiente de 2,93±0,47, el valor de Chi cuadrado es 3,16 que es menor a 9,488 (valor tabular) con 4 grados de libertad lo cual refuerza los datos obtenidos. La concentración letal media de la población del valle de Virú para Tebufenocide fue de 0,089 en un intervalo de confianza de 0,07 a 0,11 al95%, la pendiente es igual a 2,32 con un error de ±0,34. El valor de Chi cuadrado igual a 2,695 (3 grados de libertad) indica el ajuste satisfactorio de los datos. Para Metoxifenocide, la población del valle de Virú fue más susceptible que la propia población susceptible de referencia, la población del valle de lea fue 1,4 veces más resistente que la población de Lima. La población del valle de lea mostró valores similares de resistencia a ambos insecticidas, a diferencia de la población del valle de Virú.

29

Para comparar la ocurrencia de resistencia en las poblaciones de Spodoptera frugiperda evaluadas se deben considerar factores agroclimáticos y manejo del cultivo, para conocer las diferentes condiciones en la dinámica poblacional de la especie. El clima es un factor determinante en el número de generaciones de Spodoptera frugiperda así a mayor número de generaciones por año, más rápida será la evolución de la resistencia. La franja costera del valle de Virú se caracteriza por tener un clima subtropical, con temperaturas que oscilan entren 14 y 30

oc

(Guardia, L. 2011), alta

humedad relativa (77 ,9%) y menor radiación solar que el valle de lea. Estas condiciones permiten que la plaga mantenga altas poblaciones durante todo el año. Un agroecosistema aislado asegura una adecuada fuente de alimentación para las plagas durante todo el año. Es sabido que la incidencia de plagas es mucho mayor en Chavimochic, la cual, como zona agrícola es reciente en comparación al valle de lea y desde sus inicios ha tenido grandes extensiones de monocultivos como caña de azúcar, maíz, espárrago (el de mayor área sembrada) y otros. Los umbrales de acción para el control de lepidópteros, depende del plan de manejo de plagas de cada productor, el número de larvas hasta tercer estadío por metro lineal influyen directamente en la eficiencia de control, presión de selección, número de aplicaciones y costos de los programas de manejo. Una alta presión de plagas conlleva a umbrales de acción elevados, en disminución del número de aplicaciones, se espera una mayor población en diferentes estadíos, lo cual disminuye la eficiencia del insecticida y favorece la proporción de inmigración de genes resistentes. En el valle de Virú se manejan umbrales altos de acción en comparación con el valle de lea, lo que puede alterar de manera dramática la respuesta a la selección que conduce a la resistencia, debido a la tolerancia que las larvas de último estadío ofrecen al insecticida aplicado será mucho mayor. Estudios previos demuestran que Tebufenocide tiene una mayor tasa en el desarrollo de resistencia, Jia et al. (2009) en S. exigua (Hübner) seleccionaron 61 generaciOnes consecutivas y encontraron 92 veces más resistencia. A diferencia de los datos de Methoxyfenocide hallados por Mosallanejad & Smagghe (2009) tras la selección de 13 generaciones la resistencia se incrementó sólo 5 veces.

30

Un agroecosistema como el del valle de lea, que tiene más de 500 años de historia de agricultores con pequeñas y medianas extensiones que recientemente incluyeron el uso de insecticidas como protección adicional en el manejo integrado de plagas, este valle tendría una mayor biodiversidad de cultivos, plagas y las especies acompañantes como predadores, parásitoides, polinizadores, competidores y descomponedores que resulta en una complejidad ecosistémica. La especie en estudio no es la especie defoliadora más importante en el cultivo de espárrago en este valle. Andow, (1991) citado por Altieri & Nicholls (1994), menciona que en sistemas perennes las especies polífagas mantienen bajas poblaciones. La biodiversidad del agroecosistema aliviaría la presión del fitófago en el cultivo. Andow (1991) citado por Altieri & Nicholls (1994), también sostiene que en los cultivos estratificados, los insectos pueden tener dificultad para localizar y permanecer en pequeños lugares favorables si las condiciones climáticas son fuertemente alteradas. El valle de lea se caracteriza por tener un clima árido, con temperaturas extremas, baja humedad relativa inferior a (76%), con temperaturas extremas de 8,a 36°C, durante los meses de invierno las temperaturas mínimas son menores a los 10°C, disminuye también las horas de sol y la humedad relativa. Temperaturas mínimas por debajo del umbral de Spodoptera frugiperda interrumpen el ciclo biológico, disminuye el número de huevos

por postura e impide el desarrollo normal de los insectos. Valdez-Torres, et al. (2012) citado por Pérez, E. (s.f.) hallaron como umbral mínimo de temperatura 8.7°C para Spodopterafrugiperda, otros citan hasta 10,3°C. En el valle de lea la presión de la plaga

es menor. En el valle de lea se tiene entonces una autoregulación de la población que permite mantener bajos umbrales de acción por lo cual el uso de insecticidas es más eficiente y se reduce el número de aplicaciones, lo que disminuye las condiciones de desarrollo de resistencia. Las diferencias en las tasas de desarrollo de resistencia en los diferentes trabajos mencionados y lo obtenido en la presente investigación indican que la susceptibilidad varía entre especies de insectos, las clases de insecticidas y el tiempo de exposición a los compuestos químicos. Sin embargo, demuestran la existencia del gran potencial de desarrollo de resistencia innato en cada especie cuando son sometidas a presión de selección.

31

V.

CONCLUSIONES

l. La población de Spodoptera frugiperda procedente del valle de Virú es moderadamente resistente al Tebufenocide.

2. La población de Spodoptera frugiperda procedente del valle de Virú es muy suceptible al Methoxifenocide. 3. La disminución de sensibilidad a Tebufenocide hallada en la población

Spodoptera frugiperda procedente del valle de Virú puede ser manejada con el remplazo de este producto con Methoxyfenocide 4. La población de Spodoptera frugiperda procedente de lea es ligeramente resistente al Tebufenocide. 5. La población de Spodoptera frugiperda procedente de lea es ligeramente resistente al Metoxifenocide.

32

VI.

RECOMENDACIONES

l. En general el campo de los insecticidas es del interés de fabricantes, comerciantes, agricultores, técnicos agrícolas, trabajadores y ciudadanos, como múltiples _disciplinas científicas y sociales. Es necesario entonces seguir mejorando las '

estrategias de aplicación de estas sustancias para que los riesgos puedan ser minimizados. Se debería recuperar la eficiencia de Tebufenocide, por ser un insecticida específico que está en la lista de productos autorizados para espárrago de exportación.

2. Los estudios de sensibilidad y resistencia se encuentran entre las tácticas más efectivas dentro del control de plagas, como parte del programa de monitoreo para retrasar el desarrollo de resistencia en los artrópodos. Es importante investigar y promover el conocimiento de la genética y potenciales mecanismos de resistencia para poder seleccionar las tácticas de manejo más adecuadas, a fin de no perder una herramienta importante en el control de plagas de nuestro país.

33

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Altieri, M. & Nicholls, C. 1994. Biodiversidad y manejo de plagas en agroecosistemas. Icaria editorial. España. 249p. Badii, H. & Garza, V. 2007. Resistencia en Insectos, Plantas y Microoganismos. Cultura científica y tecnológica- Universidad Autónoma de Ciudad Juarez. México. 18:9. Bisset, J. 2002. Uso correcto de insecticidas: control de la resistencia. Revista Cubana de Medicina

Tropical.

Cuba.

54:3.

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39

VIII. ANEXOS ANEXO 1: Resultado del análisis estadístico probit para la población de leaMetoxyfenocide POLO-PC (C) Copyright LeOra Software 1987 input: input: input: input: input: input: input: input:

*spodoptera 0.00 40 04 0.02 40 05 0.06 40 11 0.10 39 10 0.20 40 18 0.40 39 28 0.60 36 28

preparation resp/subj spodopte . 100

dos e

log-dose

subjects

responses

.00000

.000000

40.

4.

. 02000

-1.698970

40 .

5.

. 06000

-1.221849

40 .

11.

. 10000

-1.000000

39.

10 .

. 20000

-.698970

40.

18 .

. 40000

-.397940

39.

28 .

. 60000

-.221849

36.

28 .

. 125 .275 .256 .450 .718 .778 Nurnber of preparations: 1 Nurnber of dose groups: 6 Do you want probits [Y] ? y Is Natural Response a parameter [Y] ? y Do you want the likelihood function to be maximized [Y] ? y LD's to calculate [10 50 90] > 50 Do you want to specify starting values of the parameters [N] ? n The probit transformation is to be used Natural Response is a parameter The parameters are to be estimated by maximizing the likelihood function Maximum log-likelihood

spodopte NATURAL S LO PE

parameter 1.1072044 .10875760 1.8678875

-144.47893 standard error .24713087 .43139412E-01 .41426326

40

t ratio 4.4802351 2.5210729 4.5089383

Variance-Covariance matrix spodopte spodopte NATURAL S LO PE

S LO PE

NATURAL

.6107367E-01 .2452846E-02 .8531160E-01

.2452846E-02 .1861009E-02 .1023340E-01

.8531160E-01 .1023340E-01 .1716140

Chi-squared goodness of fit test preparation probability spodopte

subjects

responses

expected

40. 40. 39. 40. 39. 36. 40.

5. 11. 10. 18. 28. 28. 4.

5.042 8.628 12.007 19.372 26.558 28.165 4.350

NATURAL

chi-square .45

1.7870

degrees of freedom

deviation -.042 2. 372 -2.007 -l. 372 l. 442 -.165 -.350

4

.126049 .215692 .307882 .484299 .680964 .782347 .108758

heterogeneity

Index of significance for potency estimation: g(.90)=.13308 g(.95)=.18895 g(.99)=.32635 Effective Doses 0.99 LOSO spodopte .13106

0.90

0.95

lower

.18081

.16509

upper

.33720

.35660

dos e

lirnits

.25541

.40212

spodopte subjects 234 controls 40 log(L)=-144.5 slope=l.868+-.414 nat.resp.=.109+-.043 heterogeneity=.45 g=.189 LD50=.255 limits: .165 to .357 Stop - Program terminated.a

41

ANEXO 2: Resultado del análisis estadístico probit para la población de La MolinaMetoxyfenocide POLO-PC (C) Copyright LeOra Software 1987 .input: input: input: input: input: input: input:

0.00 0.01 0.10 0.20 0.35 0.50 0.60

preparation resp/subj spodopte .081

37 39 40 38 38 39 38

03 06 12 25 29 35 37 log-dose

dos e

subjects

responses

.00000

. 000000

37 .

3.

.01000

-2.000000

39.

6.

.10000

-1.000000

40.

12.

.20000

-.698970

38.

25.

.35000

-.455932

38.

29.

.50000

-.301030

39.

35.

.60000

-.221849

38.

37.

.154 .300 .658 .763 .897 .974 Number of preparations: 1 Number of dose groups: 6 Do you want probits [Y] ? y Is Natural Response a parameter [Y] ? y Do you want the likelihood function to be maximized [Y] ? y LD's to calculate [10 50 90] > 50 Do you want to specify starting values of the parameters [N] ? n The probit transformation is to be used Natural Response is a parameter The parameters are to be estimated by maximizing the likelihood function Maximum log-likelihood

spodopte NATURAL S LO PE

-115.96191

parameter 2.1677976 .11784303 2.9302085

standard error .28913895 .36807964E-01 .47203134

t ratio 7.4974252 3.2015634 6.2076567

Variance-Covariance matrix

spodopte NATURAL S LO PE

spodopte .8360133E-01 .5521003E-03 .1221195

NATURAL .5521003E-03 .1354826E-02 .4019876E-02

42

S LO PE .1221195 .4019876E-02 .2228136

Chi-squared goodness of fit test preparation probability spodopte

subjects

responses

expected

39. 40. 38. 38. 39. 38. 37.

6. 12. 25. 29. 35. 37. 3.

4.600 12.579 22.836 31.203 35.585 35.836 4.360

NATURAL

chi-square .79

3.1603

degrees of freedom

deviation l. 400 -.579 2.164 -2.203 -.585 1.164 -l. 360

4

.117941 .314482 .600937 . 821138 .912427 .943065 .117843

heterogeneity

Index of significance for potency estimation: g(.90)=.07021 g(.95)=.09969 g(.99)=.17218 Effective Doses 0.99 LD50 spodopte .11557

dos e

limits

.18205

0.90

0.95

lower

.14216

.13360

upper

.21809

.22497

.23866

spodopte subjects 232 controls 37 log(L)=-116.0 slope=2.930+-.472 nat.resp.=.118+-.037 heterogeneity=.79 g=.100 LD50=.182 limits: .134 to .225 Stop - Program terminated.

43

ANEXO 3: Resultado del análisis estadístico probit para la población del valle de Virú Metoxyfenocide POLO-PC (C) Copyright LeOra Software 1987 input: input: input: input: input: input:

0.00 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50

preparation resp/subj spodopte . 000

40 36 40 40 40 36

00 08 24 34 34 34 dos e

log-dose

subjects

responses

.00000

.000000

40 .

o.

.05000

-l. 301030

36.

8.

.10000

-1.000000

40.

24 .

.20000

-.698970

40 .

34.

.30000

-.522879

40 .

34.

.50000

-.301030

36 .

34.

. 222 . 600 . 850 . 850 . 944 Number of preparations: 1 Number of dose groups: 5 Do you want probits [Y] ? y Is Natural Response a parameter [Y] ? y Do you want the likelihood function to be maximized [Y] ? y LD's to calculate [10 50 90] > 50 Do you want to specify starting values of the parameters [N] ? n The probit transformation is to be used The parameters are to be estimated by maximizing the likelihood function

Maximum log-likelihood

spodopte S LO PE

-88.889943

parameter 2.4370893 2.3239689

standard error .30701724 .33537910

Variance-Covariance matrix

spodopte S LO PE

spodopte .9425958E-01 .9647225E-01

S LO PE

.9647225E-01 .1124791

44

t ratio 7.9379558 6.9293789

Chi-squared goodness of fit test preparation probability

subjects

responses

expected

36. 40.

8. 24.

10.036 21.801

-2.036 2.199

.278782 .545032

40. 40. 36.

34. 34. 34.

31. 672 35.565 34.519

2.328 -1.565 -.519

.791806 .889134 .958851

spodopte

chi-square .90

2.6927

degrees of freedom

deviation

3

heterogeneity

Index of significance for potency estimation: g(.90)=.05635 g(.95)=.08000 g(.99)=.13818

Effective Doses 0.99 LD50 spodopte .05867

dos e

limits

.08940

0.90

0.95

lower

.07049

.06662

upper

.10757

.11114

.11831

spodopte subjects 192 controls 40 log(L)=-88.89 slope=2.324+-.335 nat.resp.=.000+-.000 heterogeneity=.90 g=.080 LD50=.089 limits: .067 to .111 Stop - Program terminated.

45

ANEXO 4: Resultado del análisis estadístico probit para la población de leaTebufenocide POLO-PC(C) Copyright LeOra Software 1987 input: input: input: input: input: input: input:

0.00 0.16 0.30 0.40 0.50 0.80 l . 20

preparation resp/subj spodopte .050

40 40 37 39 40 36 38

02 11 22 24 30 32 35 log-dose

dos e

subjects

responses

.00000

.000000

40.

2.

.16000

-.795880

40.

11.

. 30000

-.522879

37.

22 .

. 40000

-.397940

39.

24 .

. 50000

-.301030

40.

30 .

. 80000

-.096910

36.

32 .

1.20000

.079181

38.

35.

.275 .595 .615 .750 .889 .921 Number of preparations: 1 Number of dose groups: 6 Do you want probits [Y] ? y Is Natural Response a parameter [Y] ? y Do you want the likelihood function to be maximized [Y] ? y LD's to calculate [10 50 90] > 50 Do you want to specify starting values of the parameters [N] ? n The probit transformation is to be used Natural Response is a parameter The parameters are to be estimated by maximizing the likelihood function Maximum log-likelihood

spodopte NATURAL S LO PE

-128.58201

parameter 1.3296678 .48699976E-01 2.4628031

standard error .17793681 . 33441118E-01 .38587868

t ratio 7.4726968 1.4562903 6.3823249

Variance-Covariance matrix

spodopte NATURAL S LO PE

spodopte NATURAL .3166151E-01 -.4475017E-03 -.4475017E-03 .1118308E-02 .5559318E-01 .2198156E-02

46

S LO PE .5559318E-01 .2198156E-02 .1489024

Chi-squared goodness of fit test preparation probability spodopte

subjects

responses

expected

40. 37. 39. 40. 36. 38. 40.

11. 22. 24. 30. 32. 35. 2.

12.002 19.989 25.521 29.415 31.286 35.698 l. 948

NATURAL

C:hi-square .30

l. 2168

degrees of freedom

deviation

-1.002 2. 011 -l. 521 .585 .714 -.698 .052

4

.300040 .540255 .654381 .735378 .869066 .939431 .048700

heterogeneity

Index of significance for potency estimation: g(.90)=.06642 g(.95}=.09431 g(.99}=.16288 Effective Doses 0.99 LD50 spodopte .19223

0.90

0.95

lower

.23050

.21815

upper

.34185

.35217

dos e

limits

.28847

.37287

spodopte subjects 230 controls 40 log(L)=-128.6 slope=2.463+-.386 nat.resp.=.049+-.033 heterogeneity=.30 g=.094 LD50=.288 limits: .218 to .352 Stop - Program terminated.

47

ANEXO 5: Resultado del análisis estadístico probit para la población de La MolinaTebufenocide POLO-PC (C) Copyright LeOra Software 1987 input: input: input: input: input: input: input: input:

0.000 0.008 0.016 0.050 0.500 0.800 l. 200 l. 600

preparation resp/subj spodopte .000

36 40 40 39 40 41 38 39

00 03 05 15 23 26 29 36 log-dose

dos e

subjects

responses

. 00000

.000000

36 .

o.

. 00800

-2.096910

40 .

3.

. 01600

-1.795880

40 .

5.

.05000

-1.301030

39.

15.

. 50000

-.301030

40 .

23.

.80000

-.096910

41.

26.

1.20000

.079181

38.

29.

1.60000

. 204120

39 .

36.

.075 .125 .385 .575 .634 .763 .923 Number of preparations: 1 Number of dose groups: 7 Do you want probits [Y] ? y Is Natural Response a parameter [Y] ? y Do you want the likelihood function to be maximized [Y] ? y LD's to calculate [10 50 90] > 50 Do you want to specify starting values of the parameters [N] ? n The probit transformation is to be used The parameters are to be estimated by maximizing the likelihood function Maximum log-likelihood

spodopte SLOPE

-141.61045

parameter .68104528 .96680671

Variance-Covariance matrix spodopte spodopte .1207374E-01 S LO PE .7263607E-02

standard error .10988055 .10504244

S LO PE .7263607E-02 .1103391E-01

48

t ratio 6.1980512 9.2039626

Chi-squared goodness of fit test preparation probability spodopte

subjects

responses

expected

40. 40. 39. 40. 41. 38. 39.

3. 5. 15. 23. 26. 29. 36.

3.564 5.826 10.999 26.069 29.582 29.475 31.595

chi-square 8.1256 1.6251

degrees of freedom

deviation

-. 564 -.826 4.001 -3.069 -3.582 -.475 4.405

5

.089109 .145662 .282038 .651734 .721516 .775654 .810134

heterogeneity

Index of significance for potency estimation: g(.90)=.07789 g(.95)=.12676 g(.99)=.31190 'Effective Doses 0.99 LD50 spodopte .05322

0.90

0.95

lower

.11350

.09518

upper

.33757

.39736

dos e

limits

.19750

.66567

spodopte subjects 277 controls 36 log(L)=-141.6 slope=.967+-.105 nat.resp.=.000+-.000 heterogeneity=1.63 g=.127 LD50=.198 limits: .095 to .397

49

ANEXO 6: Resultado del análisis estadístico pro bit para la población del valle de Virú - Tebufenocide POLO-PC(C) Copyright LeOra Software 1987 input: input: input: input: input: input: input: input:

0.0 0.3 0.4 0.5 0.9 1.3 1.6 2.3

preparation resp/subj spodopte .053

38 35 39 37 39 37 39 40

02 12 20 20 24 28 32 35 log-dose

dos e

subjects

responses

.00000

.000000

38.

2.

.30000

-.522879

35 .

12.

.40000

-.397940

39.

20 .

. 50000

-.301030

37 .

20 .

. 90000

-.045757

39 .

24 .

l. 30000

.113943

37 .

28.

1.60000

.204120

39 .

32.

2.30000

.361728

40 .

35.

. 343 . 513 . 541 . 615 . 757 . 821 . 875 Number of preparations: 1 Number of dose groups: 7 Do you want probits [Y] ? y Is Natural Response a parameter [Y] ? y Do you want the likelihood function to be maximized [Y] ? y LD's to calculate [10 50 90] > 50 Do you want to specify starting values of the parameters [N] ? n The probit transformation is to be used Natural Response is a parameter The parameters are to be estimated by maximizing the likelihood function Maximum log-likelihood

spodopte NATURAL S LO PE

-163.55973

parameter .47971223 .52661135E-01 1.6615880

standard error .98584503E-01 .36226683E-01 .29428745

50

t ratio 4.8660003 1.4536560 5.6461396

Variance-Covariance matrix spodopte spodopte NATURAL S LO PE

NATURAL

S LO PE

.9718904E-02 -.1341456E-02 -.1341456E-02 .1312373E-02 .7083346E-02 .1736803E-02

.7083346E-02 .1736803E-02 .8660510E-01

Chi-squared goodness of fit test preparation probability

subjects

responses

expected

35. 39. 37. 39. 37. 39. 40. 38.

12. 20. 20. 24. 28. 32. 35. 2.

13.402 17.866 19.188 26.319 28.176 31.373 34.699 2.001

spodopte

NATURAL

chi-square .30

1.4961

degrees of freedom

deviatian

-1.402 2.134 .812 -2.319 -.176 .627 .301 -.001

5

.382906 . 458110 .518593 .674851 .761521 .804442 .867464 .052661

heterogeneity

Index of significance for potency estimation: g(.90}=.08487 g(.95}=.12050 g(.99}=.20813 Effective Doses 0.99 LOSO spodopte .28320

0.90

0.95

lower

.37433

.34481

upper

.64708

.67344

dos e

limits

.51439

. 72731

spodopte subjects 266 controls 38 log(L}=-163.6 slope=1.662+-.294 nat.resp.=.053+-.036 heterogeneity=.30 g=.121 LD50=.514 limits: .345 to .673 Stop - Program terminated.

51